قياس ديناميكيات نتوء حافة الخلية أثناء الانتشار باستخدام المجهر الخلوي الحي

يهدف هذا البروتوكول إلى قياس المعلمات الديناميكية (النتوءات ، التراجع ، الكشكشة) للنتوءات على حافة الخلايا المنتشرة.

وقد تبين أن اختبار نتوء حافة الخلية يرتبط ارتباطا مباشرا بهجرة الخلايا. لذلك يمكن استخدامه كطريقة أولية لتحديد البروتينات الحرجة وآليات الإشارات المشاركة في حركة الخلية. هذه الطريقة سريعة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة ولا تتطلب وضع علامات على الفلورسنت أو استخدام مجهر فلورسنت باهظ الثمن.

سيوضح الإجراء ميشال جيندلر ، وهو طالب من مختبري. أضف ملليلترين من محلول حمض الهيدروكلوريك العادي في وسط طبق زجاجي سفلي واحتضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الطبق ثلاث مرات بملليلتر من PBS.

تمييع الفيبرونيكتين عند 10 ميكروغرام لكل تركيز ملليلتر في PBS وإضافة 200 ميكرولتر من المحلول المخفف إلى طبق المركز الزجاجي. تحضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. قم بإعداد حل BSA بنسبة 1٪ و PBS وتمريره عبر مرشح 0.2 ميكرومتر.

قم بتشويه المحلول عن طريق الحضانة عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي تم تسخينه مسبقا. اغسل الطبق السفلي الزجاجي المطلي بملليلترين من PBS ثلاث مرات. أضف ملليلترين من محلول BSA المشوه واحتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

اغسل الطبق الزجاجي بملليلترين من PBS ثلاث مرات. قبل 16 إلى 18 ساعة من التجربة على 0.7 مليون خلية لكل صفيحة زراعة الأنسجة التي يبلغ قطرها 10 سنتيمترات لتحقيق التقاء 70 إلى 80٪. في اليوم التالي ، أضف ملليلترين من محلول التربسين إلى لوحة زراعة الأنسجة واحتضنها لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يتم فصل الخلايا.

أضف خمسة ملليلترات من الوسط لتعطيل التربسين. باستخدام مقياس الدم ، عد الخلايا ولوحة 20،000 خلية في ملليلترين من الوسط الكامل في طبق سفلي. ثم احتضن الطبق بخلايا مطلية في حاضنة لمدة 15 دقيقة.

قم بتشغيل وحدة التدفئة واضبطها على 37 درجة مئوية قبل ساعة واحدة من التصوير. أيضا ، قم بتشغيل وحدة ثاني أكسيد الكربون واضبطها على 5٪ 10 دقائق قبل التصوير. قم بتشغيل المجهر والكاميرا.

قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج اقتناء المجهر. اضبط التكبير على تباين مرحلة العدسة الجافة 40X. اضبط إجمالي مدة الفيلم على 10 دقائق مع فاصل زمني مدته خمس ثوان.

بعد 15 دقيقة من الحضانة ، ضع الطبق السفلي الزجاجي مع الخلايا الملتصقة في محول وقم بإصلاحه. أدخل المحول مع الطبق في الفتحات في مرحلة المجهر. اخلع غطاء الطبق ، وضع غطاء ثاني أكسيد الكربون وافتح صمام ثاني أكسيد الكربون.

حدد موقع خلية مناسبة للتصوير. ابدأ الحصول على الفيلم بعد التركيز على الخلية. لإجراء تحليل الصورة، حدد الأداة المستقيمة في برنامج تحليل الصور واجعل ثمانية أسطر من 20 وحدة عشوائية عمودية على النتوءات في ترتيب شعاعي عند كل 45 درجة، بما في ذلك الصفيحة وحافة الخلية.

في شريط الأدوات الرئيسي ، انتقل إلى الصورة ، وحدد Stacks ثم انقر فوق Reslice لإنشاء صورة kymograph تصف حركة النقاط المفردة داخل غشاء الخلية. باستخدام صور kymograph ، قم باستخراج عدد النتوءات والتراجع والكشكشة في كل منطقة من المناطق الثماني في الخلية المميزة بخطوط الشبكة وعدها يدويا. تمثل هذه الأرقام تواتر النتوءات والتراجع والكشكشة لكل 10 دقائق.

تحديد ثبات النتوء والمسافة والسرعة عن طريق تحليل الكيموغرافيا. لتحديد مسافة النتوء ، ارسم خطا عموديا من قاعدة النتوء إلى أعلى قمة للنتوء. اضغط على M لقياس طول الخط بالبكسل والتأكد من أن نسبة البكسل إلى الميكرومتر معروفة بتحويل الطول بالميكرومتر.

تم إجراء تحديد كمي للنتوءات والتفاعلات والكشكشة يدويا لكل 10 دقائق وكان متوسط التردد الذي تم الحصول عليه للنتوءات والتراجع 5.1 و 2.1 للكشكشة. كان للكيموجراف التمثيلي مسافة نتوء تبلغ حوالي 4.8 ميكرومتر ووقت نتوء يبلغ حوالي 0.6 دقيقة. يتم تمثيل مثال على خلية يجب استبعادها من التحليل.

كشف تحليل الكيموغرافيا أن الخلية لم تكن موجودة في مرحلة انتشارها ولم تظهر أي نتوءات غشائية واضحة. الشيء الأكثر أهمية هو اختيار الخلايا الصحيحة للتصوير. يجب أن تكون الخلية المناسبة في مرحلة انتشارها ويجب ألا تلمس الخلايا الأخرى لتجنب الاتصال والإشارات بين الخلايا الخلوية.

يمكن استخدام هذه الطريقة كأداة أولية لاختبار ديناميكيات الهيكل الخلوي التي تنطوي على حركة الخلية قبل اتخاذ قرار بإجراء المزيد من النتائج التي تتطلب فحوصات هجرة الخلايا.