تحديد دور الجينات المعبر عنها من الأم في النمو المبكر باستخدام المقرمشات الأمومية

دور العديد من الجينات المعبر عنها من قبل الأم خلال التطور المبكر غير معروف حاليا. تسمح تقنية كريسبر الأمومية هذه بالتحديد السريع لجينات تأثير الأم ودورها في التنمية. يوجه الحمض النووي الريبي متعدد الإرسال إلى جين واحد ، ويسمح للباحثين بتحديد الأنماط الظاهرية الجديدة لتأثير الأم في جيل واحد.

هذا البحث مفيد لفهم وظيفة نسخ الحمض النووي الريبوزي المرسال في الأمشاج ، والتي هي ضرورية لتكوين الأجنة في وقت مبكر. مفتاح هذه التقنية هو الحقن الدقيق للأجنة في وقت مبكر من مرحلة الخلية الواحدة ، والتحقق لمعرفة غالبية دليل الحمض النووي الريبي يمكن أن يحدث طفرات جسدية في الأجنة المحقونة. لإنشاء قالب RNA إرشادي لكل أوليغونوكليوتيد محدد للجين ، قم بتحليل أوليغونوكليوتيد ثابت واملأ المعلقات ببوليميراز الحمض النووي T4.

بعد تجميع قوالب الحمض النووي الريبي الإرشادية الأربعة، قم بتنقيتها وتركيزها معا باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي والمكثف. قم بتوليف خليط sgRNA من قالب الحمض النووي الريبي المجمعة ، باستخدام مجموعة نسخ T7 في المختبر ، وقم بإجراء النسخ في المختبر كما هو موضح في المخطوطة. للتحقق من سلامة sgRNA ، قم بصب 1٪ agarose 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر ، هلام بروميد الإيثيديوم Tris-Borate-EDTA.

ضع الجل المتصلب في المخزن المؤقت Tris-Borate-EDTA. امزج خليط ميكرولتر sgRNA واحد ، ومخزن مؤقت واحد لتحميل هلام الحمض النووي الريبي ميكرولتر. قم بتحميل هذه العينة في الجل وقم بتشغيل الجل عند 100 فولت لمدة خمس دقائق.

تصور العصابات باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. قم بإعداد الصلبان البرية وصناديق تزاوج الزرد. احتفظ بالأسماك الذكرية والأنثوية في نفس الخزان ، ولكن افصلها باستخدام مقسم صندوق التزاوج ، أو كما هو موضح هنا ، عن طريق وضع الأنثى داخل إدراج وضع البيض.

بعد تجميع كوكتيل الحقن ، اسمح للذكر والأنثى بالتزاوج عن طريق إزالة مقسم صندوق التزاوج ، أو كما هو موضح هنا ، عن طريق وضع الذكر في نفس إدراج وضع البيض مثل الأنثى. لمزامنة الأجنة ، اجمعها بعد 10 دقائق باستخدام مصفاة بلاستيكية ، وشطفها في طبق بتري باستخدام وسائط 1XE3. قم بإزالة 10 إلى 15 جنينا ووضعها في طبق بتري منفصل ليتم الاحتفاظ بها كعناصر تحكم غير محقونة.

انقل الأجنة المتبقية إلى آبار صفيحة الحقن. حقن واحد نانولتر البروتين sgRNA الحل، في القرص الأرومي النامية من جنين خلية واحدة. استخدم الملقط لكسر طرف الإبرة المسدودة وإعادة معايرة الإبرة لإخراج بلعة نانولتر واحدة.

في اليوم التالي بعد الحقن ، اجمع ستة أجنة محقونة صحية واثنين من أجنة التحكم من اللوحة غير المحقونة. ضع كل جنين على حدة في بئر واحد من أنبوب شريط PCR وقم بتسمية الجزء العلوي من الأنابيب. صمم برايمر فريد للفحص لكل موقع دليل لتضخيم جزء من الحمض النووي المقترن من 100 إلى 110 قاعدة يتضمن الموقع المستهدف لتقنية CRISPR-Cas9.

إذا كان ذلك ممكنا ، ضع الموقع المستهدف في منتصف الجزء المضخم ، مما يسمح بتحديد عمليات الحذف الأكبر. لكل موقع من المواقع الأربعة المستهدفة الإرشادية، قم بإعداد ثمانية تفاعلات PCR سعة 25 ميكرولتر باستخدام خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الجنيني الجيني المحضر و 20 ميكرولتر من مزيج PCR، وتوجيه خليط التمهيدي المحدد للفحص، لتحديد الطفرات الجسدية في الموقع المستهدف. قم بصب 2.5٪ من الأغاروز ، 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من هلام بروميد الإيثيديوم Tris-Borate-EDTA باستخدام أمشاط تخلق آبارا بعرض 0.625 سم تقريبا.

ثم ضع الجل المتصلب في غرفة الرحلان الكهربائي التي تحتوي على مخزن مؤقت يعمل بالتريس بوراتيه EDTA. أضف خمسة ميكرولترات من صبغة التحميل 6X إلى منتج PCR. قم بتحميل 25 ميكرولتر من هذا الخليط في الجل ، مما يضمن تشغيل عينات الحقن والتحكم على نفس صف الجل.

بعد تحميل جميع العينات ، أضف خمسة ميكرولترات من بروميد الإيثيديوم لكل لتر واحد من المخزن المؤقت Tris-Borate-EDTA ، إلى النهاية الإيجابية لصندوق الهلام. قم بتشغيل الجل عند 120 فولت حتى يتم حل حظر الحمض النووي أو يقترب الحمض النووي من نهاية الحارة. لتحديد الأنماط الظاهرية لتأثير الأم وأجنة كريسبر الأمومي ، قم بإعداد الإناث المحقونة F0 ضد الذكور من النوع البري والتحكم في الصلبان البرية في صناديق تزاوج أسماك الحمار الوحشي القياسية خلال فترة ما بعد الظهر قبل التجربة.

ضع الأسماك الذكرية والأنثوية في نفس الخزان ، ولكن افصلها بمقسم صندوق التزاوج ، أو ضع الأنثى داخل إدراج وضع البيض. في صباح يوم التجربة ، اسمح للذكر والأنثى بالبدء في التزاوج عن طريق إزالة مقسم صندوق التزاوج ، أو وضع الذكر في نفس إدراج وضع البيض مثل الأنثى. اجمع الأجنة كل 10 دقائق عن طريق تحريك إدراج وضع البيض في قاع خزان تزاوج جديد يحتوي على مياه النظام العذبة ، وقم بتسمية الخزان بعلامة تحدد أنثى F0 الفردية.

خذ خزان التزاوج القديم واسكب الماء من خلال مصفاة T لجمع الأجنة من قابض فردي واحد لمدة 10 دقائق. تحت مجهر تشريحي مع مصدر ضوء متسامي ، راقب الأجنة التي تمر بالتطور كل ساعة ، خلال الساعات الست إلى الثماني الأولى ، ويوميا للأيام الخمسة التالية. انقل أجنة كريسبر الأم المحتملة إلى طبق بتري يحتوي على وسائط 1XE3 ، وفحص النمط الظاهري المورفولوجي في 24 ساعة بعد الإخصاب ، والجدوى ، في خمسة أيام بعد الإخصاب.

في فترة ما بعد الظهر قبل التجربة ، قم بإعداد أزواج تزاوج من الإناث F0 عن طريق إبقاء الذكور من النوع البري منفصلين جسديا عن الإناث ، باستخدام مقسم مربع التزاوج أو وضع الأنثى في إدراج وضع البيض. في صباح يوم التجربة ، قم بإزالة القسم المادي لبدء التزاوج. عند أول علامة على وضع البيض ، قاطع التكاثر عن طريق فصل الذكور والإناث F0 ، واحتفظ بكل أنثى F0 منفصلة في صناديق تزاوج فردية.

بعد الإخصاب في المختبر ، اسمح للأجنة الفردية بالتطور حتى يتم ملاحظة النمط الظاهري CRISPR للأم ، ووضع هذه الأجنة في طبق بتري مختلف. بمجرد تحديد الأجنة الفردية CRISPR للأمهات ، اسمح لها بالتطور لمدة ست ساعات على الأقل بعد الإخصاب. لاستخراج الحمض النووي الجينومي من ما لا يقل عن 10 أجنة فردية من كريسبر للأمهات ، ضع جنينا فرديا واحدا في بئر فردي من أنبوب شريط PCR ، وقم بإزالة وسائط E3 الزائدة من البئر ، وأضف 50 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 50 مللي مولار.

احتضن الأجنة لمدة 20 دقيقة عند 95 درجة مئوية، وقم بتبريدها إلى أربع درجات مئوية. ثم أضف خمسة ميكرولترات من حمض تريس-هيدروكلوريك المولي مع درجة الحموضة 7.5 ، ودوامة لمدة خمس إلى 10 ثوان. لتحديد مواقع الدليل التي تحتوي على indels ، قم بتصميم الاشعال للتسلسل لتضخيم جزء من الحمض النووي بما في ذلك جميع المواقع المستهدفة الأربعة CRISPR / Cas9.

قم بإعداد اثنين من تفاعلات PCR 25 ميكرولتر لكل جنين ، باستخدام خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الجيني المحضر ، وتمهيديات التسلسل. بعد الانتهاء من PCR ، قم بتنقية وتركيز العينتين باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي والمكثف ، وإرسال جزء الحمض النووي إلى تسلسل Sanger ، باستخدام الاشعال للتسلسل الأمامي والخلفي. يجب تجميع جميع الحمض النووي الريبي الإرشادي مع الحد الأدنى من المناطق المتداخلة أو معدومة بين الحمض النووي الريبي الموجه أثناء توليد كريسبر للأمهات.

إذا تم إنشاء indels ، فيجب ملاحظة مسحة في العينات المحقونة على هلام الأغاروز ، ولكن ليس في التحكم غير المحقون. يمكن استخدام طريقة كريسبر للأمهات لتصوير طفرات تأثير الأم المعروفة ، مثل موتلي ، tmi ، وهالة. لتحديد الآفات الجينية التي تساهم في النمط الظاهري ل CRISPR للأمهات ، يتم الجمع بين الحيوانات المنوية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية والإخصاب في المختبر لإنشاء فرديات CRISPR للأمهات.

يسمح إنشاء الفريد بتسلسل سانجر للأليل الأمومي ، وتحديد إندلس كريسبر للأمهات. عند تحديد النمط الظاهري للتأثير غير الأمومي ، من الضروري أن تكون قادرا على ملاحظته في العديد من الإناث F0 ، لأنه يزيد من احتمالات أن النمط الظاهري ناتج عن فقدان الوظيفة ، وليس عن التأثيرات المستهدفة أو غير المحددة. بعد تحديد النمط الظاهري لتأثير الأم، يمكن استخدام أجنة كريسبر للأمهات لفحص التأثيرات على جوانب مختلفة من التكوين الجنيني المبكر، مثل الهيكل العظمي للجيوب الأنفية أو فصل الحمض النووي.

هذا يسمح للباحثين بفهم السبب الجزيئي للنمط الظاهري. تختبر هذه الطريقة مباشرة وظيفة الجينات غير المعروفة المعبر عنها من الأم في جيل واحد ، مما يسرع من فهمنا للعمليات ، ويعمل أثناء التكوين الجنيني المبكر.