التعرف على مصدر البروتينات المفرزة في الكلى عن طريق حقن بريفيلدين أ

تمكننا تقنيتنا من تحديد المصدر والمساهمة النسبية للخلايا المنتجة للسيتوكين في الكلى المصابة. يتيح لنا استخدام Brefeldin A لمنع إفراز البروتين جمع المزيد من المعلومات حول الخلايا التي تنتج السيتوكينات في الأعضاء الصلبة مثل نوع الخلية وحالة هذه الخلايا.

يجب أن يكون بروتوكولنا قابلا للتكيف بسهولة مع العديد من أنظمة الأعضاء. نظرا لأن Brefeldin A هو جزيء صغير منفذ للخلية ، يجب أن يثبط الإفراز في معظم أنواع الخلايا ، مما يسمح باكتشاف السيتوكينات والبروتينات المفرزة الأخرى.

حقن عظم الذنب هو الخطوة الأكثر تحديا من الناحية الفنية لأن عظم الذنب للفأر صغير جدا. نوصي بممارسة هذه الخطوة قبل تنفيذ بروتوكولنا على التجارب.

[مدرب] ابدأ بوضع نصف القفص ، ونصفه بعيدا عن وسادة التسخين لمدة 10 دقائق للتأكد من دفء الفئران. بعد وضع الفأر في جهاز تقييد ، قم بتطهير الذيل باستخدام بوفيدون اليود ومسحة الكحول ثلاث مرات. امسك الذيل أفقيا وتصور عروق الذيل الجانبية. ثم أدخل إبرة قياس 28 ، مع الحفاظ على الإبرة والحقنة موازية للوريد باتجاه الرأس. حقن 200 ميكرولتر من محلول BFA 1.25 ملليغرام لكل مليلتر. يجب أن يصبح الوريد واضحا عند استبدال الدم بمحلول الحقن. ثم قم بإزالة الإبرة واضغط على الذيل برفق حتى يتوقف النزيف. أعد الفئران إلى القفص وراقبها بحثا عن نزيف إضافي أو علامات الضيق. استخدم حقنة سعة 20 ملليلتر وقم ببث الماوس ب 10 إلى 20 مل من PBS عبر البطين الأيسر بمعدل تدفق من اثنين إلى أربعة ملليلتر في الدقيقة حتى يصبح الإنشيوم واضحا. قم بإزالة الكلى عن طريق إمساك الشريان الكلوي والوريد بالقرب من الحليمة وقطع الوعاء الدموي على الجانب بعيدا عن الكلى. ثم قم بإزالة كبسولة الكلى برفق عن طريق تقشيرها يدويا أو باستخدام ملقط معقم ناعم. استخدم قلم تحديد حاجز كاره للماء وحدد أقسام الأنسجة مع الحفاظ على مسافة لا تقل عن خمسة ملليمترات من الأنسجة إلى مخطط الحاجز الكارهة للماء. ثم يضاف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على مصل حمار 3٪ و 0.1٪ تريتون في مصل ألبومين بقري 1٪ TBS أعلى القسم. احتضان درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة في غرفة رطبة. تمييع الأجسام المضادة الأولية باستخدام PBS بالتركيز المناسب. للكشف عن السيتوكينات ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الموجهة ضد TGF beta one أو PDGF-D أو CTGF في 50 ميكرولتر من PBS. أضف الجسم المضاد الأساسي المضاد لضمور العضلات البسيط المضاد مع Cy3 إلى محلول الجسم المضاد الأساسي عند 1: 200 تخفيفات لتسمية الخلايا الليفية العضلية. قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب وأضف الأجسام المضادة الأولية إلى القسم ، مع التأكد من عدم تسربه من المخطط الدائري الكارهة للماء. احتضن بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية في غرفة رطبة. قم بإزالة الغرفة المرطبة من الحاضنة واغسل الشرائح باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة من واحد إلى 200 باستخدام PBS. احتضان العينات ب 50 ميكرولتر من محاليل الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة. قم بإزالة الشرائح من الحجرة المرطبة واغسلها باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. مخفف لوتس رباعي اللوتس ليكتين مترافق مع الفلورسين في PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم بتركيز 10 ميكروغرام لكل مليلتر. ثم احتضان الأنسجة ب 50 ميكرولتر من محلول LTL لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة. قم بإزالة الشرائح من الحجرة المرطبة واغسلها باستخدام PBS بالكالسيوم والمغنيسيوم لمدة خمس دقائق. احتضان الأنسجة ب 50 ميكرولترا من DAPI لتلطيخ نوى الحمض النووي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل مرة واحدة باستخدام PBS. أضف 20 ميكرولترا من كاشف التثبيت المضاد للبهتان إلى المنديل لتركيب زلات الغطاء ، ثم ضع زلة الغطاء ببطء. انتظر لمدة 24 ساعة حتى يتجمد الكاشف المضاد للبهتان قبل التصوير. قم بتشغيل المجهر المقلوب باستخدام مرحلة XY تلقائية وحدد هدف 20x. ضع الشريحة على مرحلة المجهر وحدد موقع قسم الأنسجة. ثم افتح برنامج الحصول على الصور وانقر فوق مباشر لفتح نافذة العرض المباشر. ابحث عن قسم المناديل وتأكد من تركيزه. انقر فوق قائمة اكتساب وحدد مسح صورة كبيرة ضوئيا. قم بإعداد المنطقة المراد مسحها ضوئيا عن طريق تحريك المسرح باستخدام عصا التحكم إلى الجزء الأقصى الأيسر من قسم المناديل ثم انقر فوق السهم الأيسر. كرر هذا لأجزاء الأنسجة العلوية واليمينية والسفلية. انقر فوق قائمة الاكتساب وتأكد من تحديد خانة الاختيار الخاصة بالالتقاط متعدد القنوات. لالتقاط صور متعددة القنوات ، انقر فوق علامة التبويب lambda ، وانقر فوق كل قناة واضبط وقت التعرض على مستوى يكون فيه التلوين واضحا دون تشبع أي جزء من الصورة. كرر هذا مع كل قناة سيتم جمعها. ثم انقر فوق مسح. افتح برنامج الحصول على الصور وانقر فوق ملف. ثم انقر فوق فتح وحدد الصورة. انقر بزر الماوس الأيمن فوق نافذة الصورة واختر عائد استثمار متعدد الأضلاع. حدد الخطوط العريضة لعائد الاستثمار باستخدام أداة يدوية. ثم حدد الخطوط العريضة لخلايا النبيبات الموجبة LTL أو الخلايا الخلالية الإيجابية ألفا SMA. انقر فوق علامة تبويب القياس ثم الحد. قم بإعداد حدود العتبة العلوية والسفلية عن طريق ضبط أشرطة التمرير على جانبي منطقة الإشارة الموجبة. ثم انقر فوق علامة التبويب عائد الاستثمار. أخيرا ، انقر فوق رمز التصدير لحفظ القيم. استخدم برنامج جداول البيانات لحساب النسب المئوية لمنطقة الإشارة الموجبة حسب منطقة عائد الاستثمار.

[مقدم العرض] تظهر الحويصلات الإيجابية لبيتا TGF في اليوم الثالث بعد إعطاء السيسبلاتين أو المحلول الملحي في الصور التمثيلية. لوحظت الحويصلات الإيجابية لبيتا TGF في PTCs المسمى ب LTL في الكلى المعالجة بالسيسبلاتين في وجود BFA. ومع ذلك ، لم يتم ملاحظة هذه الحويصلات في الكلى غير المصابة أو غير المعالجة BFA.

[مدرب] كشف التعديل عن زيادة في منطقة إيجابية بيتا TGF مع علاج BFA في إصابة الكلى الحادة الناجمة عن السيسبلاتين. على غرار TGF beta ، تراكمت الحويصلات الإيجابية PTGF-D أو CTGF الإيجابية أيضا مع علاج BFA في AKI المستحث عن السيسبلاتين. أظهر القياس الكمي أن المناطق الإيجابية PDGF-D و CTGF الإيجابية قد زادت أيضا بشكل كبير مع BFA في خلايا النبيبات القريبة الإيجابية LTL لم يؤدي حقن BFA إلى زيادة مستويات BUN في البلازما بشكل كبير في اليوم الثالث بعد حقن السيسبلاتين. لوحظت حويصلات إيجابية بيتا TGF في الخلايا الخلالية المسماة ألفا SMA في سيسبلاتين AKI مع علاج BFA. كشف التعديل أن المناطق الإيجابية لبيتا TGF في المنطقة الإيجابية لضمور العضلات الشوكي ألفا قد زادت بشكل كبير مع علاج BFA في سيسبلاتين AKI. على غرار الحويصلات الإيجابية لبيتا TGF ، زادت الحويصلات الإيجابية CTGF أيضا مع علاج BFA. أظهر القياس الكمي أن علاج BFA عزز نسبة المنطقة الإيجابية CTGF إلى المنطقة الإيجابية ل alpha SMA في CISPLATIN المستحث AKI. بالمقارنة مع الإصابة الناجمة عن السيسبلاتين ، كانت الحويصلات الإيجابية TGF-beta في PTCs أصغر بكثير في المرحلة المزمنة من AA. كان هناك الحد الأدنى من التلوين الإيجابي في PTCs الإيجابية LTL. ومع ذلك ، تمت زيادة شدة إشارة TGF beta في جزيء إصابة الكلى واحد PTCs إيجابي مع علاج BFA. كان متوسط مستوى شدة TGF beta أعلى بثلاث مرات مع حقن BFA مقارنة ب BFA.

الخطوة الأكثر أهمية هي التأكد من نجاح حقن وريد الذيل. الحقن الفاشل من شأنه أن يتخلص من النتائج. لذا يرجى البحث عن علامات النجاح مثل وضوح الوريد مع الحقن ويرجى البحث عن علامات الفشل مثل التورم على ذيول.

يمكن دمج حقن Brefeldin A مع عدد من المقايسات بما في ذلك اللطخة الغربية أو قياس التدفق الخلوي لتقييم إنتاج السيتوكين على مقياس عضو أو خلية واحدة.

باستخدام هذه التقنية ، تمكنا من تحديد السيتوكينات الجديدة التي تفرزها الخلايا الظهارية الكلوية التي كان يعتقد سابقا أنها تأتي من أنواع أخرى من الخلايا. يمكن استخدامه لتسوية المناقشات طويلة الأمد حول مساهمة أنواع معينة من الخلايا في الإصابة.