تحدد فحوصات ACT1-CUP1 الحساسيات الخاصة بالركيزة للمتحولات spliceosomal في الخميرة الناشئة

يوفر اختبار ACT1-CUP1 ، وهو فحص نمو النحاس ، قراءة سريعة لربط الحمض النووي الريبي رسول السلائف (pre-mRNA) وتأثير عوامل الربط الطافرة على وظيفة spliceosomal. توفر هذه الدراسة بروتوكولا وتسلط الضوء على التخصيص الممكن لمعالجة مسألة الربط ذات الأهمية.

يمكن لمقايسة ACT1-CUP1 تحديد ما إذا كانت الطفرة تؤثر على ربط الحمض النووي الريبي قبل الرسول ، وإعطاء إشارة إلى خطوة الربط الأكثر تأثرا. يربط اختبار ACT1-CUP1 طفرة عامل الربط بتأثيرها على عملية الربط المعقدة. يستخدم القراءة البسيطة للنمط الظاهري للنمو وله نطاق حساسية واسع.

يعد الاستخدام الفعال للوقت أمرا مهما عند إجراء فحص ACT1-CUP1. ابدأ بفحص من خمس إلى 10 سلالات لتقليل انحرافات النمو الناجمة عن الإجهاد. سأكون أنا وإيزابيل ماراسيغان ، باحثة جامعية من مختبري.

للبدء ، أضف 790 ملليغرام من أجار وشريط تحريك لكل زجاجة. في دورق كبير ، قم بإعداد وسائط نمو تسرب الليوسين لسكب جميع الألواح النحاسية. يتضمن ذلك 265 ملليجراما من قاعدة نيتروجين الخميرة ، و 64 ملليجراما من مزيج التسرب ، ناقص الليوسين ، و 34 ملليلترا من الماء منزوع الأيونات لكل طبق يتم سكبه.

يقلب ليذوب ثم أضف 34 ملليلترا من محلول وسائط نمو الليوسين المتسرب إلى كل زجاجة محضرة سعة 100 ملليلتر ، وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم. بعد ذلك ، الأوتوكلاف لتعقيم وحل أجار ، وذلك باستخدام دورة السائل الموصى بها للأوتوكلاف. في أسرع وقت ممكن بعد التعقيم ، أضف أربعة ملليلتر من الجلوكوز بنسبة 20٪ إلى كل زجاجة.

بعد ذلك ، قم بمطابقة ملصق الأنبوب مع ملصق الزجاجة لإضافة التخفيفين المليلتر من كبريتات النحاس إلى الزجاجة المقصودة. باستخدام طبق التحريك ، امزج لمدة 30 ثانية تقريبا واسكب أو ماصة 35 ملليلتر في اللوحة المصنفة ، وتجنب الفقاعات. لكل سلالة خميرة ، أضف تسعة ملليلتر من وسائط نمو التسرب من الليوسين ، وملليلتر واحد من الجلوكوز بنسبة 20٪ إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلتر.

باستخدام عصا معقمة ، أو طرف ماصة ، اجمع عينة صغيرة من الخميرة وقم بتلقيح الوسائط. بعد ذلك ، هز جميع الثقافات الليلية عند 180 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الثقافة إلى كفيت ، تحتوي على 900 ميكرولتر من الماء لكل سلالة.

بعد ذلك ، قم بقياس الكثافة الضوئية باستخدام مقياس الطيف الضوئي واحسب التخفيف المطلوب أن تكون بكثافة بصرية مقدارها 0.5 في الحجم النهائي البالغ ملليلتر. بعد ذلك ، قم بتخفيف كل سلالة إلى الكثافة الضوئية 0.5 في 10٪ من الجلسرين وأعد قياس الكثافة الضوئية للتأكد من أن كثافة الخلية ضمن النطاق المطلوب. بعد إعداد موقع عمل معقم ، أشعل موقد بنسن.

بالنسبة لجهاز النسخ المتماثل المكون من 48 سنا ، ماصة 200 ميكرولتر من كل سلالة مخففة في بئر منفصل من لوحة 96 بئرا ، واملأ المساحات الفارغة في شبكة ستة في ثمانية ب 200 ميكرولتر من 10٪ جلسرين. بعد ذلك ، اغمس جهاز النسخ المتماثل في طبق ضحل من الإيثانول بنسبة 95٪ واللهب لتعقيمه. اتركه يبرد لمدة دقيقتين على الأقل بعد إطفاء اللهب لتجنب صدمة الحرارة للخلايا.

ضع أربع لوحات بالقرب من الموقد وأزل الأغطية. اغمس جهاز النسخ المتماثل في لوحة 96 بئرا وارفعه لأعلى بحركة واحدة سريعة. ثم ضعه برفق على الطبق وصخر برفق ذهابا وإيابا لتسهيل النقل الجيد.

ارفع لأعلى بحركة سريعة واحدة وضعها في نفس الاتجاه بالضبط في لوحة 96 بئر. بعد طلاء الصفيحة ، تحرك بحركة سلسة إلى الجانب ، ولكن لا يزال داخل مظلة تعقيم اللهب. اترك الأطباق تجف تماما قبل وضع الأغطية ، عادة من ثلاث إلى خمس دقائق.

ثم احتضان الألواح لمدة ثلاثة أيام عند 30 درجة مئوية. بعد إزالة الألواح من الحاضنة ، افحصها بصريا. أظهر فحص النمو أنه مع زيادة تركيز النحاس ، تظهر السلالات ذات الربط المنخفض انخفاضا في الالتقاء ، لدرجة أن تركيز النحاس يصبح قاتلا.

تتضمن خلفية الخميرة جين ADE2 المعطل ، مما يؤدي إلى أن تكون المستعمرات درجات متفاوتة من اللون الأحمر. وكانت المستعمرات الناضجة حمراء داكنة اللون. أثناء الطلاء ، إذا تم رفع جهاز النسخ المتماثل أثناء التحرك يسارا أو يمينا ، أو تم إحضاره بزاوية ، أو إذا اهتز فوق اللوحة ، فمن الممكن إنشاء مستعمرات بيضاوية الشكل ، أو مستعمرات صغيرة من قطرات صغيرة من محلول الخلية.

نجت الخميرة مع مراسل A3c إلى 0.15 مليمولار من النحاس بينما حافظت خلايا المراسل من النوع البري على صلاحيتها حتى نهاية نطاق تركيزات النحاس التي تم اختبارها. أظهرت نتائج الفحص أن القواعد المختلفة في موقع U6 snRNA 57 لها تأثيرات فريدة على spliceosome بالاشتراك مع طفرة 5 برايم ، أو طفرة موقع فرع. في حين أن U57c عبارة عن طفرة مضافة ، مما يقلل من تحمل النحاس ، بالاشتراك مع A3c ومراسلي موقع الفرع G.

في المقابل ، يزيد U57a من تحمل النحاس لأنه يعزز التقدم إلى الخطوة الثانية. بعد تحديد اضطراب الربط من خلال ACT1-CUP1 ، يمكن أن ينتقل البحث إلى طرق أكثر كمية ، مثل تمديد التمهيدي وتحديد التفاعل الجزيئي المعطل من خلال EMSAs والتحقيق الأنزيمي. كان ACT1-CUP1 مقايسة تأسيسية ، حيث بناء فهمنا لمتانة وانتقائية سبيليسوسوم الخميرة.

ويستمر في توسيع فهمنا للوظيفة spliceosomal.