التخمير الذي يتم التحكم فيه بالضوء لإنتاج المواد الكيميائية والبروتين الميكروبي

تم استخدام علم البصريات الوراثي لتحقيق عيارات أعلى للعديد من المواد الكيميائية والبروتينات مقارنة بالمحفزات النموذجية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن للآخرين تعزيز عملياتهم الخاصة باستخدام التحكم القائم على الضوء. التحكم البصري الوراثي غير جراحي ، قابل للضبط للغاية ، وقابل للعكس.

تسمح هذه الصفات بتحسين مبسط للعمليات الميكروبية وحتى فتح فرص فريدة ، مثل التخمير ثلاثي المراحل والتحكم متعدد الألوان. بالنسبة لأي مادة كيميائية جديدة ، ستختلف ظروف الإضاءة المثلى. لذلك إذا لوحظ انخفاض الإنتاج باستخدام المعلمات الموجودة في هذا البروتوكول ، فيجب اختبار ظروف الإضاءة المختلفة.

ابدأ بالحصول على سلالة Saccharomyces cerevisiae مع أوكسيتروب HIS3 ، وهي علامة ضرورية لبلازميدات OptoINVRT. إذا كنت تسعى إلى التحكم في جين أصلي في Saccharomyces cerevisiae ، فتأكد من حذف النسخة الداخلية من الجين قبل المتابعة. لبدء بناء السلالة، قم بخطي البلازميد الذي يحتوي على دائرة OptoINVRT7، مثل EZL439.

إذا كنت تستخدم EZL439 ، الذي يحتوي على مكونات لقمع مروج PIGA واحد في الضوء وتنشيطه في الظلام ، فقم بالخطية في موقع تقييد Pme1. باستخدام طرق تحويل خلات الليثيوم القياسية ، قم بدمج البلازميد في سلالة HIS3 auxotrophic. بعد التحول ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 150 G لمدة دقيقة واحدة.

أعد تعليق الخلايا بلطف في 200 ميكرولتر من وسط SC-HIS الطازج. قم بلوحة حجم الخلية بالكامل على صفيحة SC-HIS agar واحتضنها عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى تظهر المستعمرات. إعداد الخلايا المختصة باستخدام بروتوكولات تحويل خلات الليثيوم القياسية.

قم بتحويل الخلايا باستخدام البلازميد الذي يحتوي على الجينات التي ترغب في التحكم فيها بصريا في اتجاه مجرى النهر إما من مروجي PIGA1M أو PIGA1S. بعد التحول، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 150 جم لمدة دقيقة واحدة وأعد تعليق حبيبات الخلايا بلطف في 200 ميكرولتر من وسط تسرب SC الطازج. قم بلوحة حجم الخلية بالكامل على صفيحة أجار مخلدة بتكرس العنب المستخلصة من الخميرة ، إذا تم دمجها في مواقع دلتا أو لوحة تسرب SC إذا تم تحويلها باستخدام بلازميد يحتوي على علامة اختيار.

احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 16 ساعة تحت الضوء الأزرق المستمر للحفاظ على الجين الذي يتم التحكم فيه بصريا مكبوتا. استخدم أي مصدر ضوء بطول موجي يبلغ 465 نانومتر وضع لوحة LED على ارتفاع 40 سم تقريبا فوق اللوحة بحيث تكون شدة الضوء حوالي 80 إلى 110 ميكرومول لكل متر مربع في الثانية. قياس الشدة باستخدام مقياس كمومي.

في حالة الاندماج في مواقع دلتا ، قم بتكرار اللوحة على ألواح سكر العنب المصنوعة من مستخلص الخميرة والتي تحتوي على مجموعة من تركيزات Zeocin بين 400 ميكروغرام لكل ملليلتر و 1،200 ميكروغرام لكل ملليلتر لاختيار مجموعة متنوعة من أرقام نسخ التكامل. احتضن الصفائح المقلدة عند 30 درجة مئوية تحت ضوء أزرق ثابت أو نابض لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى تظهر المستعمرات. لإجراء الفحص الأولي ، حدد ثماني مستعمرات من كل لوحة واستخدمها لتلقيح ملليلتر واحد من وسط SC-HIS المكمل بالجلوكوز بنسبة 2٪ في الآبار الفردية لصفيحة 24 بئرا.

تنمو الخلايا بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية تهتز بسرعة 200 دورة في الدقيقة تحت إضاءة الضوء الأزرق المستمرة. في اليوم التالي ، قم بتخفيف كل ثقافة في وسط SC-HIS جديد مع 2٪ من الجلوكوز للحصول على قيم الكثافة البصرية التي تتراوح من 0.01 إلى 0.3 عند 600 نانومتر وتنمو الثقافات في حالة اهتزاز 200 دورة في الدقيقة تحت ضوء ثابت أو نبضي عند 30 درجة مئوية حتى تصل الكثافة البصرية بين اثنين وتسعة. ثم ، لف الألواح بورق الألومنيوم ، وأطفئ لوحة الضوء ، واحتضن الألواح في الظلام لمدة أربع ساعات عند 30 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة.

الطرد المركزي للمزارع في صفيحة البئر 24 في 234 G لمدة خمس دقائق وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط التسرب الكامل الاصطناعي الطازج مع 2٪ الجلوكوز. قم بإغلاق الألواح لمنع تبخر المنتج المطلوب باستخدام شريط مانع للتسرب من الألواح الدقيقة المعقمة. قم بتخمير الألواح المختومة في الظلام لمدة 48 ساعة عند 30 درجة مئوية تهتز بسرعة 200 دورة في الدقيقة.

لحصاد التخميرات ، قم بالطرد المركزي للألواح لمدة خمس دقائق عند 234 جم ونقل 800 ميكرولتر من المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر. اعتمادا على المادة الكيميائية ذات الأهمية ، قم بالتحليل باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ، أو مطياف كتلة كروماتوغرافيا الغاز ، أو طريقة تحليلية أخرى باستخدام تقنية تحضير العينة الأنسب للأداة المستخدمة. اختر ثماني مستعمرات من كل صفيحة واستخدمها لتلقيح ملليلتر واحد من وسط SC-HIS مع 2٪ جلوكوز في آبار فردية من صفيحة 24 بئر.

تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في الظلام عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز 200 دورة في الدقيقة. في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف كل ثقافة في وسط SC-HIS جديد مع 2٪ من الجلوكوز إلى 0.1 كثافة بصرية. لف الألواح بورق الألمنيوم لمنع التعرض للضوء وتنمو الثقافة في الظلام عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز 200 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى كثافة بصرية تبلغ ثلاثة.

ثم احتضن الألواح تحت الضوء النبضي لمدة 12 ساعة عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز 200 دورة في الدقيقة. قم بالطرد المركزي للثقافات عند 234 G لمدة خمس دقائق وأعد تعليقها في وسط SC-HIS جديد مع 2٪ جلوكوز. قم بإغلاق الألواح لمنع تبخر المنتج المطلوب باستخدام شريط مانع للتسرب من الألواح الدقيقة المعقمة.

قم بتخمير الألواح المختومة في الضوء لمدة 48 ساعة عند 30 درجة مئوية تهتز بسرعة 200 دورة في الدقيقة. بعد إجراء التخمير البصري الوراثي ، تم اختبار الإنتاج الكيميائي في مجموعة من كثافات الخلايا في وقت الحث مع دائرتين. أظهرت دائرة OptoINVRT7 عيارات عالية من حمض اللاكتيك والأيزوبوتانول مع كثافة خلية مثالية بقيمة تحريضية تبلغ 7.0 و 8.75 مقارنة بدائرتي OptoINVRT1 و 2.

تمت دراسة عمليات التخمير باستخدام دوائر OptoAMP في ثلاث مراحل تحددها دورات عمل خفيفة مختلفة. يمكن تحسين إنتاج حمض اللاكتيك باستخدام مرحلة نمو نبضية ومراحل تحريض وإنتاج مضاءة بالكامل. تم تحسين إنتاج الأيزوبوتانول باستخدام مرحلة النمو النبضي ، ومرحلة الحث المضاءة بالكامل ، ومرحلة الإنتاج النبضي.

في حين تم تحسين التخليق الحيوي naringenin بشكل أفضل باستخدام نمو نبضي مضاء بالكامل الحث ومرحلة الإنتاج المظلمة. تم استخدام نظام OptoLAC في E.Coli لإنتاج عامل النسخ FDER عند عيارات مماثلة أو أعلى من تلك التي تم تحقيقها باستخدام الحث الكيميائي مع IPDG. تم تطبيق دوائر OptoLAC لإنتاج الميفالونات ويتجاوز الإنتاج العيار الذي تم تحقيقه باستخدام تحريض IPDG.

يوضح إنتاج Mevalonate على مستوى المفاعل الحيوي قابلية التوسع وقابلية التنظيم البصري الوراثي لإنتاج المواد الكيميائية والبروتين في البكتيريا خارج مستويات الصفائح الدقيقة. من المهم التأكد من أن شدة الضوء في النطاق المناسب للخطوات المضيئة وأنه يتم تجنب التلوث الضوئي للخطوات التي تتطلب الظلام. مهدت هذه التقنية الطريق لتحقيق عيارات قياسية من الأيزوبوتانول في الخميرة ، واستقرار مجموعات الاتحادات مع الضوء ، وحتى التحكم في التدفق الأيضي باستخدام العضيات الاصطناعية التي تسيطر عليها الضوء.