الرحلان الصوتي الموائع الدقيقة للفصل المتدفق للبكتيريا سالبة الجرام باستخدام حبات تقارب أبتامر
أكتوبر 17, 2022
تصف هذه الورقة تصنيع وتشغيل رقائق التحلل الصوتي الموائع الدقيقة باستخدام تقنية الرحلان الأكوستوفوريزي الموائع الدقيقة والميكروبيدات المعدلة بواسطة aptamer والتي يمكن استخدامها للعزل السريع والفعال للبكتيريا سالبة الجرام من الوسط.
يصف هذا البروتوكول تقنية الرحلان الأكوستوتوفريزي الموائع الدقيقة التي يمكن استخدامها للفصل السريع والفعال للبكتيريا سالبة الجرام عن الوسط باستخدام الخرز الدقيق المعدل بواسطة aptamer. تمكن أنظمة الرحلان الأيكولومبي الموائع الدقيقة من فصل البكتيريا سالبة الجرام بإنتاجية معقولة وعزل الخلايا غير الملامسة. يمكن تحسين الرحلان الأكوستوفوريزي الموائع الدقيقة لعزل البكتيريا عن العينات الطبية والبيئية.
للبدء ، قم بتصميم شريحة الرحلان الأكوستوفوريزي الموائع الدقيقة التي تجمع حبات PS عند المخرج المستهدف وتتخلص من الباقي بعد حقن خليط عينة PS في مدخل العينة. قم بإعداد شريحة مع الطبقات فوق وأسفل طبقة السيليكون المرتبطة بزجاج البورسليكات. وطبقة زجاجية ثالثة من البورسليكات ، باستخدام الأنودة ، تضيف 1000 فولت و 400 درجة مئوية.
قم بتوصيل PZT بطبقة زجاج البورسليكات على طول قناة الموائع الدقيقة باستخدام أقل من 10 ميكرولترات من مادة سيانواكريليت اللاصقة. تطعيم بكتيريا GN و GP في وسط Luria-Bertani واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة. الطرد المركزي للبكتيريا المستزرعة في 9،056 RCF لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ثم يغسل مرتين باستخدام المخزن المؤقت 1X PBS. قم بإعداد بكتيريا GN و GP المحددة للتحليل عن طريق تعليقها في المخزن المؤقت الملزم. أعد تعليق خليط الخرز الصغير المطلي بالستربتافيدين سعة 10 ميكرومتر قبل الاستخدام.
دوامة الخليط لمدة 20 ثانية. قم بتحضير الأبتامر عن طريق تمسخه عند 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ، ثم إعادة طيه عند صفر درجة مئوية لمدة دقيقتين. انقل 250 ميكرولتر من خليط الخرز الصغير المطلي بالستربتافيدين المعاد تعليقه إلى أنبوب 1.5 ملليلتر وأضف 100 ميكرولتر من أبتمير الحمض النووي البيوتينيل إلى الأنبوب.
احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أثناء الدوران بسرعة 25 دورة في الدقيقة. الطرد المركزي لخليط التفاعل عند 9،056 RCF لمدة 40 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الأنبوب مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-HCl.
أضف 10 ميكرولترات من 100 ملليغرام لكل ملليلتر BSA إلى أنبوب العينة المغسول واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء الدوران بسرعة 25 دورة في الدقيقة. أخيرا ، اغسل الخرز الصغير المعدل من aptamer مرتين في المخزن المؤقت Tris-HCl عن طريق الطرد المركزي عند 9،056 RCF لمدة 40 ثانية في درجة حرارة الغرفة. قم بتوصيل أنابيب PEEK بالمدخلين لحقن عينتين ومخزن مؤقت ، والمنفذين لجمع النفايات وتفريغها.
باستخدام حقنة 10 ملليلتر ، املأ قناة الرحلان الأكوستوفوريسيس الموائع الدقيقة بالماء الخالي من الفقاعات. قم بإعداد وحدة تحكم في الضغط الدقيق مع قناتي إخراج أو أكثر للتحكم في تدفق السوائل. بعد تحضير الجهاز، قم بحقن العينة والمخزن المؤقت عن طريق تطبيق ضغط قدره كيلوباسكال على مدخل العينة وأربعة كيلوباسكال على مدخل المخزن المؤقت باستخدام جهاز التحكم الدقيق في الضغط.
باستخدام المجهر ، ركز على حبة وانقلها إلى مركز قناة الموائع الدقيقة باستخدام PZT. توليد تردد رنين يبلغ 3.66 ميغاهرتز باستخدام مولد وظيفة أحادي القناة وتضخيم إشارة نموذجية بمقدار 16 ديسيبل باستخدام مضخم طاقة. راقب عمليات الفصل والإثراء على رقاقة الموائع الصوتية باستخدام مجهر فلوري وكاميرا عالية السرعة تعمل بسرعة 1،200 إطار في الثانية.
أكدت الشريحة الصوتية التي تم تقديمها في هذه الدراسة أنه مع زيادة جهد PZT ، زاد التركيز المركزي للخرز بحجم 10 ميكرومتر. عند خمسة فولت من جهد PZT ، تركزت معظم الخرز بحجم 10 ميكرومتر في المركز. يشار إلى نسبة عدد الخرز الذي تم جمعه في المخرج إلى العدد الإجمالي للخرز المحقون بحجم 10 ميكرومتر باسم معدل الاسترداد.
يشار إلى نسبة عدد الخرز بحجم 10 ميكرومتر إلى إجمالي عدد الخرز الذي تم جمعه باسم النقاء. أشارت النتائج إلى أن الجهاز يتمتع بكفاءة فصل عالية للخرز بحجم 10 ميكرومترات. تم قياس أعداد بكتيريا GN و GP المرتبطة بكل حبة صغيرة معدلة من aptamer باستخدام مجهر مزود بكاميرا عالية السرعة.
كانت جميع بكتيريا GN الخمسة مرتبطة بالخرز بينما كان عدد أقل بكثير من بكتيريا GP مرتبطا بالمواد التي تم اختبارها. اختلفت قوة الإشارة اختلافا كبيرا بين بكتيريا GN و GP. يجب استخدام المادة اللاصقة المستخدمة لإرفاق PZT بأقل قدر ممكن من الدقة للتموج ويجب أن تكون PZT والقناة الدقيقة متوازية.
يمكن استخدام هذا الجهاز للكشف عن البكتيريا الحية أو المؤشرات الحيوية المشتقة من البكتيريا في فترة التشخيص المبكر للأمراض المعدية البكتيرية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تقنية للرحلان الصوتي الموائع دقيقية (microfluidic acoustophoresis) للفصل السريع والفعال للبكتيريا سالبة الجرام من أوساط مختلفة. وتعتمد الطريقة على استخدام حبيبات دقيقة معدلة بالأبتامرات لتعزيز عملية العزل، مما يتيح فصل الخلايا دون تلامس وبإنتاجية معقولة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الموائع الدقيقة
- الرحلان الصوتي
- علم الأحياء الدقيقة
خلفية علمية
- تتيح الأنظمة الموائعية الدقيقة التحكم الدقيق في السوائل على المقياس الميكروني.
- تعد عملية الفصل الصوتي تقنية تستخدم الموجات الصوتية للتحكم في الجسيمات.
- تشكل البكتيريا سالبة الجرام تحديات كبيرة عند العزل بسبب خصائصها التركيبية.
- الأبتامرات هي قليلات النوكليوتيد قصيرة أحادية السلسلة التي يمكنها الارتباط بشكل انتقائي بأهداف محددة.
الغرض من الدراسة
- تطوير شريحة صوتية مائعية دقيقة (acoustophoresis) لفصل البكتيريا بكفاءة.
- تحسين عملية العزل لكل من العينات الطبية والبيئية.
- إثبات فاعلية الخرزات الدقيقة المعدلة بالأبتامرات في تعزيز كفاءة الفصل.
الطرق المستخدمة
- تصميم شريحة صوتية مائعة دقيقة.
- ربط طبقات من السيليكون وزجاج البوروسيليكات لتصنيع الشريحة.
- حقن خليط عينة PS في الشريحة لغرض الفصل.
- تطبيق عملية الأنودة تحت ظروف محددة من الجهد ودرجة الحرارة.
النتائج الرئيسية
- نجح نظام الفصل الصوتي ميكروفلويديك في عزل البكتيريا سالبة الجرام.
- تم تحقيق فصل عالي الإنتاجية وبدون تلامس.
- أدت الخرزات الدقيقة المعدلة بالأبتامر إلى تحسين كفاءة العزل بشكل ملحوظ.
- هذه الطريقة قابلة للتطبيق على كل من العينات الطبية والبيئية.
الاستنتاجات
- تُعد تقنية الفصل الصوتي الموائع مجهرياً تقنية واعدة لعزل البكتيريا.
- تعزز تعديلات الأبتمر من انتقائية وكفاءة هذه العملية.
- يمكن أن تكون هذه التكنولوجيا مفيدة لتطبيقات متنوعة في علم الأحياء الدقيقة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح طريقة الفصل الصوتي الميكروفلويدي هذه عزلاً سريعاً وعالي النقاء للبكتيريا سالبة الغرام من المصفوفات المعقدة، مما يعالج عقبة حرجة في تشخيص الأمراض المعدية في مراحلها المبكرة والرصد البيئي. ومن خلال الجمع بين الفصل الصوتي الخالي من الوسوم والنوعية القائمة على الأبتامرات، تدعم هذه التقنية تقليل المخاطر المرتبطة بالأهداف في سير عمل اكتشاف مضادات الميكروبات والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية. ويوفر استرداد بنسبة >98% ونقاء بنسبة 97.8% عند تركيز 10x، كما تم إثباته، بديلاً قابلاً للتوسع وغير تلامسي للطرد المركزي أو الترشيح لتحضير العينات في المرحلة قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح التحقق الوظيفي من أهداف البكتيريا سالبة الجرام من خلال عزل المسببات المرضية الحية من عينات بيولوجية أو بيئية غير متجانسة.
- القيمة التشغيلية: تقلل من وقت معالجة العينات وتحد من التلف الجزيئي الحيوي مقارنة بتقنيات الفصل التقليدية.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال توفير أجزاء بكتيرية منقاة لدراسات ارتباط الهدف وآلية العمل.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توفير مدخلات بكتيرية منقاة لاختبارات الفرز المظهري، مما يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة الناتجة عن الأنواع الملوثة من البكتيريا موجبة الجرام.
- القيمة التشغيلية: توحيد معايير تحضير العينات من خلال التركيز الصوتي الترددي القابل للتكرار والالتقاط بوساطة الأبتامر.
- القابلية للتوسع: يسمح تصميم القنوات المتفرعة بالمعالجة والتنقية والتركيز في وقت واحد، مما يحقق إنتاجية أعلى في سلسلة عمليات الفرز.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يربط بين مراحل الاكتشاف والمراحل ما قبل السريرية من خلال تمكين العزل المتسق للبكتيريا سالبة الجرام من مصفوفات شبيهة بالعينات السريرية مثل الدم أو البول.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: يسهل الكشف عن البكتيريا الحية أو المؤشرات الحيوية المشتقة منها في تطبيقات التشخيص المبكر، مما يدعم تطوير المؤشرات الحيوية الترجمية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: تعمل مقاييس الاسترداد والنقاء العالية على تعزيز الثقة في المقاييس اللاحقة المستخدمة لتقييم المركبات الرائدة.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن النطاق الممتد من الاكتشاف المبكر إلى الدراسات قبل السريرية، حيث تدعم تحديداً عملية تحضير العينات للتحقق من الهدف، وجاهزية المقايسة، والدراسات الميكانيكية التي تكون فيها نقاوة البكتيريا سالبة الغرام أمراً بالغ الأهمية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات عن طريق عزل سلالات معينة من البكتيريا سالبة الغرام من المزارع المختلطة أو العينات البيئية لتقليل المخاطر المرتبطة بالأهداف.
- الفحص: تتيح الحصول على مجموعات بكتيرية جاهزة للمقايسة مع الحد الأدنى من انتقال المكونات المداخلة، مما يحسن من دقة الفحص.
- التحليلات: توفر مخرجات كمية عبر المجهر الفلوري والتصوير عالي السرعة، مما يسمح بحساب نسب ارتباط الخرزات بالبكتيريا ومقارنات قوة الإشارة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط سير العمل قبل السريري من خلال تمكين العزل من عينات ذات صلة طبياً، مما يدعم الاستمرارية في تطوير نماذج الأمراض المعدية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يتيح التصميم القائم على الرقائق وأنظمة الموائع التي يتم التحكم فيها بالضغط التوحيد القياسي عبر المختبرات والتكيف مع أنواع العينات المختلفة دون الحاجة إلى إعادة التصميم.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة في التحقق من الهدف عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي الناتج عن شوائب العينات.
- القيمة التشغيلية: تضمن إمكانية التكرار من خلال التحكم الدقيق في القوة الصوتية والتحضير الموحد لخرز الأبتامر.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن موثوقية قرارات المتابعة أو الإيقاف في برامج مضادات الميكروبات من خلال تقديم مدخلات بيولوجية عالية الدقة.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد أولويات المركبات الرائدة وفقاً للمخاطر بناءً على بيانات ميكانيكية أكثر دقة من الأجزاء البكتيرية المنقاة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تصميم الموائع الدقيقة، وتحسين معاملات التوجيه الصوتي، وبروتوكولات ربط الأبتامر بالخرزات.
- يعتمد على المحولات الكهرضغطية، ومولدات الدوال، ومضخمات الطاقة، والمجهر الفلوري المزود بإمكانية التصوير عالي السرعة.
- يستلزم توحيد ظروف المحلول المنظم، ومعدلات التدفق (2 kPa للعينة، 4 kPa للمحلول المنظم)، ومعايرة جهد PZT بين المستخدمين.
- قد يتطلب التكيف مع أنواع بكتيرية مختلفة أو مصفوفات عينات أخرى إعادة تحسين عملية اختيار الأبتامر وتردد الرنين الصوتي.
- تشمل القيود العملية حدوث تجعد في القناة ناتج عن المادة اللاصقة في حالة استخدام كمية زائدة من السيانوأكريليت، مما يؤثر على انتظام المجال الصوتي.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Microuidic Acoustophoresis Chip Design and Fabrication
1:23
Bacterial Strains and Culture
1:56
Microbeads and Immobilization of Aptamer onto Microbeads
3:10
Acoustophoresis Setup and Operation
4:19
Results: Using Microfluidics to Capture GN Bacteria from Culture Samples at High Speed
5:26
Conclusion
