القياس الكمي لتوزيع الجليكوجين تحت الخلوي في ألياف العضلات الهيكلية باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل
فبراير 7, 2022
يزيد إجراء ما بعد التثبيت المعدل من تباين جزيئات الجليكوجين في الأنسجة. توفر هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة يصف كيفية التعامل مع الأنسجة وإجراء التصوير واستخدام الأساليب المجسمة للحصول على بيانات كمية وغير متحيزة حول توزيع الجليكوجين تحت الخلوي الخاص بنوع الألياف في العضلات الهيكلية.
يعد قياس محتوى الجليكوجين في الخلايا المفردة والمنظمات دون الخلوية أمرا مهما لأنه في معظم أنواع الخلايا ، تتكيف الخلايا المفردة بشكل مختلف مع الظروف والأمراض الفسيولوجية المتغيرة. لذا ، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الدقة العالية جدا في المجهر الإلكتروني الناقل. هذا يحسن من إمكانية وجود هياكل تحت خلوية موضعية وأيضا في هذا المحتوى في هذه التقنية هنا ، من المهم أن يكون تلطيخ الجليكوجين خاليا من الأجسام المضادة.
لذلك ، ليس لدينا أي خصوصية تدعو للقلق. من أجل الحصول على تباين أفضل على الجليكوجين ، ما عليك سوى استخدام فيروسيانيد البوتاسيوم بنسبة 1.5٪ بدلا من فيروسيانيد البوتاسيوم. تحضير 1.6 ملليلتر من المحلول المثبت الأساسي عن طريق إضافة 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.1 مول الصوديوم كاكوديلات المخزن المؤقت في أنبوب تركيز دقيق 2 ملليلتر.
قم بتخزينه في خمس درجات مئوية لمدة أقصاها 14 يوما. عزل عينة صغيرة من خزعة العضلات أو العضلة بأكملها التي يبلغ قطرها الأقصى ملليمترا واحدا في أي اتجاه وهي أطول طوليا من المقطع العرضي. ضع العينة في الأنبوب الذي يحتوي على محلول التثبيت الأولي البارد.
تخزينها في خمس درجات مئوية لمدة 24 ساعة. ثم اغسل العينة أربع مرات في 0.1 مخزن مؤقت كاكوديليات الصوديوم المولي. باستخدام ماصات النقل ، قم بإزالة المخزن المؤقت المستخدم من الأنبوب تاركا العينة دون أن تمسها وأضف المخزن المؤقت الطازج.
بعد إصلاح العينة مع 1٪ من رابع أكسيد الأوزميوم و 1.5٪ من فيروسيانيد البوتاسيوم في 0.1 مخزن مؤقت كاكوديليت الصوديوم المولي لمدة 120 دقيقة عند أربع درجات مئوية. شطف العينة مرتين في الماء المقطر المزدوج في درجة حرارة الغرفة. الجفاف عن طريق الغمر في سلسلة متدرجة من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة.
تسلل إلى العينة مع أكسيد البروبيلين ومخاليط الراتنج الإيبوسيدي المتدرج في درجة حرارة الغرفة باستخدام نسب الحجم المذكورة. في اليوم التالي ، قم بتضمين العينات في راتنج epossidic طازج بنسبة 100٪ في قوالب وبلمرة عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. قم بتركيب كتلة عينة على حامل ultramicrotome.
قم بتقليم الكتلة على السطح باستخدام شفرة حلاقة للوصول إلى مستوى الأنسجة. قم بتركيب سكين الماس أمام العينة ومحاذاة سطح العينة بالتوازي مع السكين. قم بإنتاج قسم شبه رقيق بسماكة ميكرومتر واحد باستخدام سكين الماس للتحقق من اتجاه العينة.
قم بتلطيخ القسم شبه الرقيق باللون الأزرق تولويدين للمراقبة باستخدام المجهر الضوئي. ثم قم بتقليم الكتلة أكثر لتقليل مساحة الاهتمام للحصول على أقسام رقيقة للغاية مناسبة. قطع 60 إلى 70 نانومتر سماكة أقسام رقيقة جدا بسكين الماس الثاني.
اجمع قسما إلى قسمين على شبكة نحاسية كاملة باستخدام حلقة مثالية. لمقارنة الأقسام ، اغمر الشبكات في محلول أسيتات اليورانيل لمدة 20 دقيقة واغسل الشبكات في ماء مقطر مزدوج ثم اغمر الشبكات في سترات الرصاص لمدة 15 دقيقة وأعد غسل الشبكات في ماء مقطر مزدوج. قم بتشغيل كمبيوتر المجهر الإلكتروني الناقل وبرنامج تسجيل الصور ، وسجل الصور الرقمية باستخدام كاميرا CCD الرقمية للمسح البطيء وبرنامج التصوير المرتبط بها.
بعد إدخال الشبكة بأقسام متعددة في مرحلة المجهر ، قم بفحص الشبكة في البداية عند تكبير منخفض لاختيار أفضل الأقسام جودة وتحديد اتجاه ألياف العضلات. التركيز البؤري التالي ، الصورة عند التكبير فوق 30،000 مع تركيز الشعاع على ألياف طرفية في القسم وتسجيل الصور مع وقت التعرض ثانية واحدة في التكبير المطلوب. تأكد من توزيع الصور عبر طول وعرض الألياف في ترتيب منهجي عشوائي للحصول على نتائج غير متحيزة وتكرار التصوير حتى يتم تصوير ستة إلى 10 ألياف.
استيراد الصور إلى الصورة J عن طريق النقر على ملف متبوعا بفتح. قم بتعيين مقياس عمومي لمطابقة الحجم الأصلي للصورة من خلال النقر فوق تحليل ثم تعيين مقياس. للتكبير بنسبة 100٪ ، انقر فوق الصورة ، وانتقل إلى التكبير وانقر على.
قم بقياس سمك قرص Z واحد لكل صورة لمساحة myofibrillar باستخدام أداة الخط المستقيم من قائمة الأدوات واحسب متوسط سمك قرص Z لكل من الألياف الستة إلى 10. استخدم أداة الخط المجزأ لقياس طول myofibril الخارجي المرئي أسفل المنطقة تحت الساركوليمال مباشرة. لإدراج شبكة، انقر فوق تحليل، وحدد أدوات، ثم حدد شبكة.
الآن اضبط المساحة لكل نقطة على 32،400 نانومتر مربع. احسب عدد الزيارات ضمن الطول المتاح في 12 صورة تحت الساركوليمال حيث يضرب الصليب الجليكوجين تحت الساركوليمال. أدخل شبكة بالنقر فوق تحليل، ثم حدد أدوات، متبوعة بشبكة وحدد المساحة لكل نقطة عند 160،000 نانومتر مربع.
احسب عدد الزيارات في صور myofibrillar 12th حيث يضرب الصليب الفضاء داخل myofibrillar. ثم مرة أخرى ، لإدراج شبكة ، انقر فوق تحليل ، وحدد الأدوات ثم حدد الشبكة. الآن اضبط المساحة لكل نقطة على 3،600 نانومتر مربع.
عد عدد الزيارات في الصور 12th myofibrillar حيث يضرب الصليب الجليكوجين داخل myofibrillar. أدخل شبكة بالنقر فوق تحليل، ثم حدد الأدوات، متبوعا بالشبكة وحدد المساحة لكل نقطة عند 32،400 نانومتر مربع. عد عدد الزيارات في الصور ال 12 myofibrillar حيث يضرب الصليب الجليكوجين intermyofibrillar.
باستخدام شبكة 32،400 نانومتر مربع لاختيار جزيئات الجليكوجين عشوائيا ، ابدأ بالمربع العلوي الأيسر وانتقل إلى اليسار إذا لزم الأمر. باستخدام أداة الخط المستقيم ، قم بقياس قطر خمسة جزيئات جليكوجين مختارة عشوائيا لكل تجمع لكل صورة من الصور ال 12 للحصول على متوسط 60 جسيما لكل تجمع لكل ألياف. يوضح هذا الشكل القيم الطبيعية لبرك الجليكوجين الثلاثة.
يمكن ملاحظة أن قيم الجليكوجين intermyofibrillar موزعة بالقرب من المعدل الطبيعي ، في حين أن كلا من الجليكوجين داخل myofibrillar و subsarcolemmal يظهر توزيعا منحرفا حيث تحتوي الألياف في بعض الأحيان على كمية زائدة من الجليكوجين. من بين جميع الخطوات ، من المهم جدا استخدام فيروسيانيد البوتاسيوم. يمكن الجمع بين تحليل الجليكوجين وتحليل الميتوكوندريون وقطرات الدهون التي يمكن أن تحسن فهمنا لكيفية ارتباط المكونات الأيضية الرئيسية الأخرى مع الجليكوجين وصحة العضلات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة إجراء تعديل لما بعد التثبيت يعزز تباين جزيئات الجليكوجين في الأنسجة. يوضح البروتوكول تفاصيل التعامل مع الأنسجة، وتقنيات التصوير، والأساليب الستيريولجية لتحديد كمية توزيع الجليكوجين في العضلات الهيكلية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم الأنسجة
الخلفية
- قياس محتوى الجليكوجين أمر بالغ الأهمية لفهم استجابات الخلايا للتغيرات الفسيولوجية.
- تظهر الخلايا المفردة تكيفات متنوعة مع الظروف والأمراض.
- التصوير عالي الدقة ضروري لملاحظة الهياكل دون الخلوية.
- تتجنب التقنية مشكلات الخصوصية باستخدام تلطيخ الجليكوجين الخالي من الأجسام المضادة.
غرض الدراسة
- لتحسين تباين جزيئات الجليكوجين في عينات الأنسجة.
- لتوفير بروتوكول مفصل للتصوير والتحليل.
- للحصول على بيانات غير متحيزة حول توزيع الجليكوجين في العضلات الهيكلية.
الطرق المستخدمة
- إجراء تعديل لما بعد التثبيت باستخدام سيانيد الحديد البوتاسيوم.
- تحضير محلول التثبيت باستخدام غلوتارالدهيد ومخزن الصوديوم كاكوديل.
- التصوير المجهري الإلكتروني للنقل للتصوير عالي الدقة.
- الأساليب الستيريولجية للتحليل الكمي.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق تباين محسن لجزيئات الجليكوجين.
- يسمح البروتوكول بالتصوير الدقيق للهياكل دون الخلوية.
- تم التحقق من التحديد الكمي غير المتحيز لتوزيع الجليكوجين.
- التقنية قابلة للتطبيق على أنواع مختلفة من الأنسجة.
الاستنتاجات
- يحسن الإجراء المعدل بشكل كبير من تصور الجليكوجين.
- يوفر طريقة موثوقة لدراسة الجليكوجين في العضلات الهيكلية.
- يسهل فهمًا أفضل للتكيفات الخلوية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This TEM-based glycogen quantification method enables high-resolution subcellular analysis critical for de-risking metabolic target hypotheses in skeletal muscle. By resolving glycogen distribution across distinct subcellular compartments, it provides mechanistic insights that improve predictive confidence in preclinical models of metabolic disease. The approach supports early discovery workflows requiring subcellular phenotyping and biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glycogen storage patterns to clarify metabolic pathway involvement in disease models.
- Operational Value: Provides subcellular resolution to distinguish artifactual from biologically relevant glycogen accumulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ultrastructural data (volume fraction, particle diameter) for assay standardization across subcellular glycogen pools.
- Operational Value: Supports development of reproducible, antibody-free staining protocols compatible with high-throughput EM imaging.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links subcellular glycogen distribution to mitochondrial and lipid droplet morphology for integrated metabolic phenotyping.
- Operational Value: Enables cross-comparison of glycogen dynamics in disease-relevant skeletal muscle models prior to preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where subcellular metabolic phenotyping informs target validation and lead identification decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing non-uniform glycogen storage that challenges homogeneous assumptions in metabolic modeling.
- Screening: Delivers quantitative glycogen readouts (volume fraction, particle size) enabling comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs stereological grid-based counting to generate unbiased, statistically robust estimates of glycogen distribution.
- Translational Research: Connects glycogen ultrastructure to organelle morphology, supporting biomarker alignment in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized TEM workflow for subcellular glycogen quantification applicable across multiple skeletal muscle studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving glycogen heterogeneity at the subcellular level.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and stereological analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing subcellular metabolic context that complements bulk biochemical assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on subcellular glycogen phenotypes in disease models.
Implementation Considerations
- Expertise in TEM sample preparation, ultramicrotomy, and stereological analysis is required.
- Access to transmission electron microscopy with digital imaging capabilities and image analysis software (e.g., ImageJ) is essential.
- Standardization across teams requires adherence to fixed staining concentrations (e.g., potassium ferrocyanide 1.5%) and grid-based counting parameters.
- Adaptation to other muscle fiber types or tissue systems may require optimization of sectioning and staining protocols.
- Methodological limitations include sampling bias if fiber orientation or section distribution is not randomized, as noted in the protocol.
