تقنية تجزئة الأنابيب الدقيقة الكمية لفصل الأنابيب الدقيقة المستقرة والأنابيب الدقيقة المرنة والتوبولين الحر في أنسجة الفئران
نوفمبر 17, 2023
تلعب الأنابيب الدقيقة ، وهي بوليمرات توبولين ، دورا مهما كمكون للهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة ومعروفة بعدم استقرارها الديناميكي. طورت هذه الدراسة طريقة لتجزئة الأنابيب الدقيقة لفصلها إلى أنابيب دقيقة مستقرة ، وأنابيب دقيقة قابلة للتعديل ، وتوبولين حر لتقييم استقرار الأنابيب الدقيقة في أنسجة الفئران المختلفة.
يساعد بروتوكولنا الجديد على تمييز وتحديد ثلاث حالات من حلقات الأنبوب ، مثل الأنابيب الدقيقة المستقرة ، والأنابيب الدقيقة المرنة ، والأنابيب الحرة في الأنسجة الحيوانية. تتكون هذه التقنية من خطوات بسيطة ويمكنها تقييم الاستقرار الهيكلي للأنابيب ، والذي لا يمكن اكتشافه عن طريق القياس الكمي للأنابيب بعد التعديل المتعدي. هذه الطريقة ضرورية للبحث وتطوير طرق علاجية للأمراض التي يكون فيها استقرار الأنابيب الدقيقة أمرا بالغ الأهمية ، مثل مرض الزهايمر والسرطانات.
ابدأ الإجراء عن طريق تحضير ملابس المختبر لتشريح الأنسجة. املأ صندوقا بالثلج المجروش وضع طبقين بتري عليه. املأ طبقا واحدا بمحلول عازل فوسفات بارد مثلج أو PBS للغسيل العابر وتخزين الأنسجة المشرحة.
ضع ورق الترشيح المبلل ب PBS على الطبق الثاني. بعد ذلك ، قم بوزن الأنابيب الدقيقة التي يبلغ سعتها 1.5 ملليلتر المملوءة ب PBS لتخزين الأنسجة المشرحة. بعد استخراج الأنسجة من فأر القتل الرحيم ، انقلها إلى الأنابيب وأعد وزن كل أنبوب دقيق.
انقل الأنسجة إلى خالط زجاجي باستخدام محلول تثبيت الأنابيب الدقيقة الباردة أو MSB + وسط ، وقم بتجانس الأنسجة على الفور باستخدام خالط مبرد. الآن نقل تجانس الأنسجة إلى أنبوب دقيق 2 مليلتر باستخدام ماصة باستور وأجهزة الطرد المركزي في 2،400 غرام لمدة ثلاث دقائق عند درجتين مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر لإزالة الحطام.
دوامة الطافية أو جزء S1 في أنبوب دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. ماصة على الفور 200 ميكرولتر من جزء S1 في أنبوب ميكرو الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 100،000 غرام باستخدام الدوار TLA-55 لمدة 20 دقيقة عند درجتين مئوية. بعد الطرد المركزي الثاني ، افصل طاف S2 عن راسب P2.
قم على الفور بنقل الكمية الكاملة من جزء S2 إلى أنبوب دقيق للطرد المركزي واستخدم دوار TLA-120.2 لتدويره عند 500،000 جم لمدة 60 دقيقة عند درجتين مئويتين. بعد الطرد المركزي الثالث ، افصل طاف S3 عن راسب P3. قم بإذابة جزء S3 بالكامل في 200 ميكرولتر من كبريتات دوديسيل الصوديوم 2X ، أو المخزن المؤقت لعينة SDS.
امزج كسور S1 المتبقية بحجم متساو من المخزن المؤقت لعينة 2X SDS لاستخدامها كمنحنى قياسي للنشاف الغربي. بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS إلى أنابيب الكسر P2 و P3. بعد ذلك ، قم بصوتنة المحلول لفترة وجيزة لإذابة الراسب قبل نقل العينات إلى أنابيب دقيقة جديدة سعة 1.5 ملليلتر ووضعها في صندوق الثلج.
غلي جميع العينات عند 100 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. شكلت الأنابيب الدقيقة في جزء P2 34.86٪ من إجمالي ألفا توبولين في دماغ الفأر ، في حين شكلت تلك الموجودة في الكسور P3 و S3 56.13٪ و 9.01٪ على التوالي. لم تكن النسبة المئوية لتوبولين بيتا 3 في كسور P2 و P3 و S3 مختلفة بشكل كبير عن تلك الموجودة في ألفا توبولين.
أظهر الجزء S2 مرورا محدودا للتوبولين عبر عمود دوران الترشيح الفائق 300 كيلو دالتون ، بينما سمح جزء S3 بمرور كامل لمجمعات التوبولين. أدى الفصل الكروماتوغرافي إلى شطف 100 كيلو دالتون من توبولين S3. تم استرداد نسب متساوية من ألفا وبيتا توبولين في كل جزء.
تم إثراء كسور P2 بشكل كبير مع ألفا توبولين الأسيتيل ، بينما كان التيروزين ألفا توبولين سائدا في جزء P3. أدى تجميد الدماغ قبل التجانس إلى انخفاض تركيز ألفا توبولين في أجزاء P2. ومع ذلك ، زاد ألفا توبولين في جزء P3.
كما قلل التجميد من مستويات الأستيل وزاد من مستويات التيروزين لألفا توبولين في جزء P2. انخفض علاج نوكودازول ألفا توبولين في جزء P2. على عكس التجميد ، لم يؤثر نوكودازول على تعديلات توبولين P2 بعد الترجمة.
أظهرت أنسجة المخ تركيزا أعلى بكثير من الأنابيب P2 ، بينما تركزت توبولين P3 في الأنسجة التكاثرية. أظهر النشاف الغربي أن توبولين P2 الموجود على وجه التحديد في الجهاز العصبي نشأ من الأنابيب الدقيقة المستقرة ، وأن توبولين P3 نشأ من الأنابيب الدقيقة المستقرة. استقرار الأنابيب الدقيقة ديناميكي للغاية.
من المهم إكمال هذا البروتوكول بسرعة ، دون انقطاع ، في بيئة درجة الحرارة الباردة. تأكد أيضا من عدم تجميد الأنسجة والكسور حتى يتم إذابتها في المخزن المؤقت لعينة SDS. من المتوقع أن يؤدي الجمع بين العرض المناعي باستخدام كل جزء مع البروتينات إلى تحديد العوامل المشاركة في ديناميكيات الأنابيب الدقيقة.
باستخدام هذه الطريقة ، كشفنا عن مدى وجود تاو الطبيعي على الأنابيب الدقيقة. يمكن استخدامه أيضا لدراسة كيف يصبح غير طبيعي في أدمغة المسنين من أجل تحديد أهداف دوائية جديدة للخرف.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً جديداً لتمييز وقياس كمية الأنابيب الدقيقة المستقرة، والأنابيب الدقيقة غير المستقرة، والتوبولين الحر في الأنسجة الحيوانية. وتقيم هذه الطريقة الاستقرار الهيكلي للأنابيب الدقيقة، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم أمراض مثل مرض الزهايمر والسرطانات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- ديناميكيات الأنابيب الدقيقة
خلفية علمية
- تعد الأنيبيبات الدقيقة مكونات أساسية للهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة.
- وتظهر هذه الأنيبيبات عدم استقرار ديناميكي، مما يؤثر على الوظائف الخلوية.
- ويعد فهم استقرار الأنيبيبات الدقيقة أمراً بالغ الأهمية للتطورات العلاجية.
- وترتبط أمراض مثل الزهايمر وأنواع معينة من السرطانات بخلل في وظائف الأنيبيبات الدقيقة.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لفصل الأنيبيبات الدقيقة في أنسجة الفئران.
- تقييم استقرار الحالات المختلفة للأنيبيبات الدقيقة.
- تعزيز فهم الأمراض المرتبطة بالأنيبيبات الدقيقة.
الطرق المستخدمة
- تجهيز ملابس المختبر لتشريح الأنسجة.
- استخدام محلول منظم من الفوسفات مبرد بالثلج للتعامل مع الأنسجة.
- فصل الأنابيب الدقيقة إلى توبولين مستقر، وتوبولين غير مستقر، وتوبولين حر.
- تقدير استقرار الأنابيب الدقيقة كمياً من خلال البروتوكول الجديد.
النتائج الرئيسية
- يميز البروتوكول بشكل فعال بين الأنيبيبات الدقيقة المستقرة وغير المستقرة.
- يكشف التحديد الكمي عن رؤى حول استقرار الأنيبيبات الدقيقة في الأنسجة المختلفة.
- تتميز هذه الطريقة بالبساطة وقابلية التكرار للاستخدام المختبري.
- تساهم النتائج في فهم ديناميكيات الأنيبيبات الدقيقة في سياقات الأمراض.
الاستنتاجات
- يُعد هذا البروتوكول الجديد أداة قيمة للباحثين الذين يدرسون استقرار الأنيبيبات الدقيقة.
- وله تطبيقات محتملة في فهم وعلاج الأمراض المرتبطة بخلل وظائف الأنيبيبات الدقيقة.
- ويمكن للأبحاث المستقبلية أن تستند إلى هذه النتائج لاستكشاف سبل علاجية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعد التقييم الدقيق لاستقرار الأنيبيبات الدقيقة أمراً أساسياً لتقييم الآليات العلاجية في الأمراض التنكسية العصبية والسرطانات التي تؤثر فيها ديناميكيات الهيكل الخلوي على الاستجابة للعقاقير. تتيح تقنية الفصل هذه التحديد الكمي المباشر لمجمعات التيوبولين المستقرة واللابية والحرة في الأنسجة الأصلية، مما يوفر قراءة كيميائية حيوية تكمل عمليات التصوير والمقاييس الخاصة بالتعديلات. ومن خلال تحليل حالات الأنيبيبات الدقيقة الوظيفية، تدعم هذه الطريقة التحقق من الأهداف والحد من المخاطر الميكانيكية في برامج الاكتشاف المبكرة التي تركز على العوامل المعدلة للأنيبيبات الدقيقة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس التحولات في مجموعات الأنيبيبات الدقيقة المستقرة مقابل غير المستقرة استجابةً للمعالجة بالمركبات.
- القيمة التشغيلية: توفر مقايسة كيميائية حيوية تعتمد على الأنسجة للتحقق من ارتباط المستهدفات بالعوامل التي تعمل على تثبيت أو زعزعة استقرار الأنيبيبات الدقيقة.
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز محفظة المشاريع من خلال ربط تثبيت الأنيبيبات الدقيقة كيميائيًا حيويًا بالنتائج الوظيفية في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تولد بيانات كمية لتجزئة التيوبولين مناسبة للفحص عالي المحتوى لمكتبات المركبات التي تستهدف ديناميكيات الأنابيب الدقيقة.
- إمكانية التكرار: تستخدم خطوات طرد مركزي فائق معيارية لتحقيق فصل متسق لأجزاء الأنابيب الدقيقة عبر التجارب المختلفة.
- القابلية للتوسع: متوافقة مع لطخة ويسترن والتحليلات البروتوميكية اللاحقة لتحديد منظمات استقرار الأنابيب الدقيقة من أحواض التيوبولين المجزأة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يكشف عن الاختلافات النوعية للأنسجة في استقرار الأنيبيبات الدقيقة التي ترتبط بالقدرة التكاثرية، مما يسمح بتصنيف النماذج قبل السريرية.
- الاستمرارية الترجمية: يربط حالات الأنيبيبات الدقيقة البيوكيميائية بتوقيعات التعديلات ما بعد الترجمة (على سبيل المثال، الأستلة في المجموعات المستقرة، والتيروزين في المجموعات غير المستقرة) لتحقيق المواءمة مع المؤشرات الحيوية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يدعم قرارات المتابعة أو التوقف من خلال توفير مقاييس استقرار كمية تتنبأ بالمؤشر العلاجي في البرامج التي تستهدف الأنيبيبات الدقيقة.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحسين المركب الرائد، حيث تُستخدم استقرارية الأنيبيبات الدقيقة كعلامة بيولوجية فارماكوديناميكية لتأكيد آلية العمل.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال قياس التحولات التي تسببها المركبات في حالات بلمرة الأنابيب الدقيقة في مستخلصات الأنسجة الأصلية.
- الفحص: تتيح توحيد المقاييس من خلال عتبات ترسيب محددة (100,000 × g للأنابيب الدقيقة المستقرة، و500,000 × g للأنابيب الدقيقة غير المستقرة) لضمان تكرار عملية الفصل.
- التحليلات: توفر قراءات كمية لبروتين tubulin عبر تحليل western blot لأجزاء P2 (المستقرة)، وP3 (غير المستقرة)، وS3 (tubulin الحر) لمقارنة تأثيرات المركبات.
- الأبحاث الترجمية: تربط بيانات فصل الأنابيب الدقيقة بأنماط التعبير الخاصة بالأنسجة وملفات التعديل من أجل التحقق قبل السريري.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة كيميائية حيوية قابلة لإعادة الاستخدام لتقييم المركبات التي تستهدف الأنابيب الدقيقة عبر مجالات مرضية وأنواع أنسجة متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي من خلال قياس حالات بلمرة الأنيبيبات الدقيقة بشكل مباشر بدلاً من الاعتماد فقط على تعديلات ما بعد الترجمة.
- القيمة التشغيلية: يضمن قابلية التكرار من خلال توحيد معايير الطرد المركزي والمعالجة تحت درجة حرارة مضبوطة للحفاظ على سلامة الأنيبيبات الدقيقة.
- القيمة الاستراتيجية: يعزز الثقة في اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال توفير تحقق متعامد للميكانيكية المستهدفة للأنيبيبات الدقيقة بما يتجاوز المقاييس الخلوية.
- التأثير على مجموعة المشاريع: يتيح تحديد أولويات المركبات بناءً على مخاطر معدلة استناداً إلى فعالية التثبيت الكمية في الأنسجة ذات الصلة بالمرض.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في تقنيات تجانس الأنسجة والطرد المركزي الفائق للحفاظ على استقرار الأنيبيبات الدقيقة أثناء المعالجة.
- تعتمد على توفر دوارات عالية السرعة (TLA-55 و TLA-120.2) قادرة على الوصول إلى 100,000 × g و 500,000 × g لفصل الأجزاء.
- تستلزم توحيد معايير توقيت التجزئة ودرجة الحرارة بين الفرق لضمان اتساق النتائج عبر المختبرات المختلفة.
- تتطلب مواءمة تركيب المحلول المنظم ومعايير الطرد المركزي عند تطبيق الطريقة على أنسجة غير عصبية ذات كثافات مختلفة من الأنيبيبات الدقيقة.
- تتقيد بضرورة المعالجة الفورية لمنع تفكك الأنيبيبات الدقيقة الاصطناعي أثناء التعامل مع العينات.
