يتم وصف بروتوكول لعزل استنساخ خلايا الورم الميلانيني المنقولة بثبات باستخدام أسطوانات زجاجية. نحن نركز على المشورة العملية التي قد تكون حاسمة لنجاح الإجراء بأكمله.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل استنساخ خلايا الورم الميلانيني المنقولة بثبات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يستخدم العلماء على نطاق واسع مجموعات الخلايا التي لديها تغييرات مستقرة في معلوماتها الجينومية كنموذج بحثي. لا تتطلب تعداء الخلايا المتكررة لأنها يمكن أن تؤدي إلى مجموعة خلايا غير متجانسة وكفاءة تعداء متغيرة ، مما يؤثر على قابلية التكاثر. علاوة على ذلك ، فهي أفضل للتحليلات واسعة النطاق. يعد توليد استنساخ الخلايا المستقرة مفيدا لمجموعة واسعة من التطبيقات ، مثل البحث عن وظائف الجينات وإنتاج البروتين المؤتلف. هناك عدة طرق للحصول على مجموعة خلايا متجانسة عند التعداء العابر الأولي. هنا ، نصف عزل المستنسخة أحادية الخلية مع الأسطوانات الزجاجية. على الرغم من أن هذه الطريقة معروفة منذ بعض الوقت ، إلا أن هناك بعض الخطوات الحاسمة ، وقد يؤدي إهمالها إلى الفشل. لقد استخدمنا هذه الطريقة بنجاح للحصول على استنساخ يفرط في التعبير بثبات عن البروتين محل الاهتمام (POI) أو بالضربة القاضية للجين المعني (GOI). نصف خطوات التحضير مثل تحسين اختيار تركيزات الدواء ، وتحضير الأسطوانات الزجاجية ، والتحقق من صحة ما إذا كانت المستنسخة التي تم الحصول عليها لديها التغيير المطلوب في التعبير عن GOI عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تحليل اللطخة الغربية ، أو التلوين المناعي ، أو تسلسل gDNA (اعتمادا على نوع المستنسخة المشتقة). نناقش أيضا عدم تجانس النمط الظاهري لخطوط الخلايا الراسخة لأن هذه قد تكون مشكلة في الحصول على استنساخ خلايا مستقرة.
المقدمة
يعد التعدي المستقر لخلايا الثدييات طريقة تستخدم بشكل روتيني في العديد من تطبيقات زراعة الخلايا ، بما في ذلك أبحاث السرطان. تتمثل ميزته على التعدي العابر في أنه لا يمكن فقدان المادة الوراثية الغريبة التي تم إدخالها بسبب العوامل البيئية (على سبيل المثال ، التقاء الخلية أو مرحلة النسخ المتماثل) وانقسام الخلية لأنها مدمجة في جينوم المضيف1. يمكن أن يكون تطوير خطوط الخلايا التي تعبر بثبات شاقا وصعبا ، ولكن إذا كان التعبير المستمر عن الجينات مطلوبا لفترة طويلة ، فإن اشتقاق خطوط الخلايا المستقرة هو الخيار المفضل. الهدف الأكثر شيوعا من التعدي هو دراسة وظائف جين معين أو منتج جيني معين عن طريق الإفرا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. زراعة الخلايا الفرعية والبذر لتحسين تركيز الدواء
- قم بتسخين وسط زراعة الخلايا (في هذه الحالة ، وسط النسر المعدل من Dulbecco بتركيز منخفض (1.5 جم / لتر) من NaHCO3 ، و 10٪ (v / v) مصل بقري الجنين (FBS) ، و 1٪ (v / v) L-glutamine ، و 1٪ (v / v) مضاد حيوي مضاد للفطريات) ومحلول التربسين في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية.
- استنشق وسيط زراعة الخلية وتخلص منه من خلايا A735 التي تنمو في قارورة ثقافة خلية T25. يتم الحصول على خط الخلية من مصادر تجارية.
- اغسل أي وسط متبقي لزراعة الخلايا عن طريق غسل القارورة ب 1 مل من محلول التربسين أو PBS.
- استنشق وتخلص من محلول التربسين أو PBS من ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام البروتوكول المقدم ، نقدم عرضا توضيحيا مفصلا لعزل استنساخ خلايا الورم الميلانيني المستقرة بطريقة الأسطوانة الزجاجية (الشكل 1 أ). تتعلق دراساتنا ببيولوجيا خلايا الورم الميلانيني ، ونموذج البحث الأكثر شيوعا الذي نستخدمه هو خط الورم الميلانيني A375 شديد التوغل. نظرا لأن بحثنا أظهر أن خلايا الورم الميلانيني تنتج الجيلسولين (GSN) على مستوى عال مقارنة بأنواع السرطان الأخرى14 ، فإننا نحقق في دور هذا البروتين في تطور الورم الميلانيني. GSN هو بروتين مرتبط بالأكتين يلعب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لقد قدمنا وصفا مفصلا لعزل استنساخ خلايا الورم الميلانيني المستقرة بأسطوانات زجاجية. من المهم الحصول على استنساخات التحكم عند اشتقاق المستنسخة ذات التعبير المتغير عن الجينات لأن النتائج التي تم الحصول عليها لاستنساخ التعديل المستهدف يجب دائما مقارنتها بالنتائج التي تم الحصول عليها لعناصر التحكم. بهذه الطريقة ، يمكننا التحقق مما إذا كان التعدي نفسه أو الثقافة باستخدام مضاد حيوي انتقائي لا تؤثر على نتائج التجارب ، بدلا من بعض العوامل الأخرى ، مثل التعديل الجيني الذي تم إدخاله. عند التخطيط ل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني للعلوم ، بولندا (المشروع # 2016/22 / E / NZ3 / 00654 ، الممنوح ل AJM).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنبوب طرد مركزي 15 مل | GoogleLab Scientific | G66010522 | |
| 150 مم مزرعة خلية مع شبكة 20 مم | Falcon | 353025 | |
| 24 بئرا | VWR International | 10062-896 | |
| طبق ثقافة 35 مم | Eppendorf | EP0030700112 | |
| 6 آبار | Eppendorf | EP0030700113 | |
| 96 بئر لوحة | VWR الدولية | 10062-900 ؛ | |
| حمض الخليك ، محلول 80٪ | Chempur | 115687330 | |
| Agarose | Prona-Abo | BLE500 | |
| المضادات الحيوية المضادة للفطريات | Gibco | 15240062 | |
| الأجسام المضادة المضادة ل GAPDH | Santa Cruz Biotechnology Inc. ، | sc-47724 | |
| الأجسام المضادة ل GSN ؛ - استنساخ C20 | Santa Cruz Biotechnology Inc. ، | sc-6405 | |
| الأجسام المضادة ل GSN - استنساخ GS-2C4 | Sigma-Aldrich | G44896 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Color Taq PCR Master Mix (2x) | EurX | E2525 | |
| Control Double Nickase Plasmid | Santa Cruz Biotechnology Inc. ، | sc-437281 | |
| Coverslips | bionovo | 16283 | |
| Dako تصاعد متوسطة | Clontech | S3023 | |
| DMSO - ثنائي ميثيل سلفوكسيد | applichem | A3672،0250 | |
| طقم تنقية الحمض النووي ؛ | EurX | 3555-02 | |
| حمار مضاد للماوس - Alexa Fluor 488 | Invitrogen | # A-21202 | |
| DTT - 1،4-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EcoRI ؛ | ثيرمو فيشر العلمي | FD0274 | |
| EDTA- حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك | Poch (Pol-Aura) | 593280117 | |
| EGTA - الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل الأثير) - N ، N ، N '، N'-حمض رباعي الأسيتيك ؛ | سيجما ألدريتش | E0396 | |
| FBS - مصل الأبقار الجنينية | Gibco | 10270-106 | |
| Gelsolin CRISPR Plasmids | Santa Cruz Biotechnology Inc. ، | sc-401005-NIC | |
| الفورمالديهايد | سيجما ألدريتش | P6148 | |
| الجلسرين | سيجما ألدريتش | L-4909 | |
| ارتفاع نسبة الجلوكوز Dulbecco s النسر المعدل s وسط مع تركيز منخفض (1.5 جم / لتر) من NaHCO3 & nbsp ؛ | الأكاديمية البولندية للعلوم,Wroc aw, Poland | 11-500 | |
| Hoechst 33342 | ثيرمو فيشر العلمي | H3570 | |
| L-الجلوتامين | جيبكو | 25030-024 | |
| اللجنين | Bionovo | B-0521 | |
| Lipofectamine 3000 كاشف التعداء | Invitrogen | L3000-008 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Na4P2O7 | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| NaF | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| NEBuilder أداة التجميع | http://nebuilder.neb.com/#!/ | ||
| pACGFP-C1 | Clontech | ||
| PageRuler Prestained بروتين سلم | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| سلم الحمض النووي المثالي 100 نقطة أساس | EurX | E3134 | |
| phalloidin-Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| كوكتيل مثبط الفوسفاتيز 2 | كوكتيل مثبط الفوسفاتيز Sigma-Aldrich | P5726 | |
| 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| Phusion عالي الدقة DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ثيرمو فيشر العلمية | 23225 | |
| بولي إيثيلينيمين (PEI) | سيجما ألدريتش | 408727 | |
| كوكتيل مثبط البروتياز | سيجما-ألدريتش | P8340 | |
| بورومايسين | إنفيفيجن | ant-pr | |
| SDS - كبريتات دوديسيل الصوديوم | سيجما ألدريتش | L4509 | |
| سيليكون | كلوريد الصوديوم CX80 Polska | ||
| - كلوريد الصوديوم | Chempur | 7647-14-5 | |
| ديوكسيكولات الصوديوم | سيجما ألدريتش | D6750259 | |
| السكروز | Poch (Pol-Aura) | PA-06-772090110 | |
| الأسطوانات الزجاجية ؛ | الأنسجة Sigma-Aldrich | C3983-50EA | |
| 25 مل | VWR International | 10062-868 | |
| قارورة زراعة الأنسجة 75 سم 2 قارورة | VWR | 10062-872 | |
| قاعدة Trisma | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| trypsin ؛ | الأكاديمية البولندية للعلوم,Wrocaw, Poland | 20-500 | |
| urea | Sigma-Aldrich | 8656 | |
| محلول الزيلين | Chempur | 115208603 |
المراجع
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Wurm, F. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً