طريقة خطوة بخطوة للكشف عن الأجسام المضادة المحايدة ضد AAV باستخدام فحص قائم على الخلايا اللونية

تشكل الأجسام المضادة الموجودة مسبقا والتي تحيد AAV عائقا أمام تقدم العلاجات الجينية AAV. هذا الفحص هو أداة فحص للكشف عن الأجسام المضادة المحايدة ضد AAV. الميزة الرئيسية هي أنها فعالة من حيث التكلفة ، وفعالة من حيث الوقت ، وسهلة الإعداد ، وتتطلب الحد الأدنى من المهارات التقنية ، ومعدات المختبر ، والكواشف.

ابدأ في طلاء خلايا HT1080 في اليوم الأول عن طريق تخفيف الخلايا إلى تركيز 1 × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر في وسائط DMEM الكاملة التي تم تسخينها مسبقا. ثم زرع 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر في لوحات واضحة ذات قاع مسطح من 96 بئرا إلى تركيز 1 × 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر. احتضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها لمدة 16 إلى 22 ساعة.

في اليوم الثاني ، قم بإنشاء تخفيفات تسلسلية لعينات المصل ذات الأهمية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 ملليلتر باستخدام DMEM الكامل الذي تم تسخينه مسبقا. إلى كل أنبوب يحتوي على عينات مصل مخففة ، أضف 66 ميكرولتر من 7.5 × 10 إلى الجينوم الفيروسي الستة لكل ميكرولتر فيروس يعمل محلولا. امزج تخفيف مصل الفيروس عن طريق السحب ثم ضع الأنابيب التي تحتوي على مخاليط مصل الفيروس في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة للسماح بحدوث تحييد محتمل.

بعد 30 دقيقة ، ماصة 100 ميكرولتر من خليط مصل الفيروس إلى كل بئر على صفيحة 96 بئرا تحتوي على 1x10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر ، ثم لف اللوحة في رقائق لوضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها لمدة 16 إلى 24 ساعة. في اليوم الثالث ، قم بسحب الوسائط من آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا باستخدام فراغ غطاء الدخان دون تعطيل الخلايا الملتصقة وإضافة 50 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde إلى كل بئر. بعد لف الطبق في رقائق معدنية ، اتركه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في وقت لاحق ، اغسل الخلايا واستنشقها مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الثاني ، قم بماصة 200 ميكرولتر من PBS المسخن مسبقا في كل بئر ولف اللوحة في رقائق تليها حضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لتشويه نشاط الفوسفاتيز القلوي الداخلي المنشأ ، بعد حضانة 50 ميكرولتر من BCIP / NBT المذاب حديثا في كل بئر واحتضان الألواح الملفوفة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين إلى 24 ساعة. في وقت لاحق ، التقط صورا لكل بئر باستخدام عدسة موضوعية 4X في كاميرا مجهر ضوئي ، مما يضمن الاستخدام المتسق لنفس التعرض والتوازن الأبيض وإعدادات الضوء لجميع المقاييس.

لتحليل الصورة في ImageJ، حدد الملف وانقر فوق فتح. بالنسبة للصور الملونة، قم بالتحويل إلى تدرج رمادي عن طريق تحديد علامات التبويب صورة ونوع و8 بت بالترتيب. ثم انتقل إلى علامة التبويب صورة وحدد ضبط وعتبة لتغيير العتبة حتى يتم تلوين جميع المساحات الملونة والحمراء ولكن الخلفية ليست كذلك.

انقر فوق تحليل وتعيين القياسات وحدد خانات الاختيار الخاصة بالمساحة وجزء المساحة والحد من العتبة وتسمية العرض قبل الضغط على OK.To تحديد قراءة الإشارة لبئر معين ، انقر فوق تحليل وقياس بحيث يعرض عمود النسبة المئوية للمنطقة في النافذة المنبثقة قراءة الإشارة. حددت الدراسة الجرعة الفيروسية المثلى عن طريق إضافة جين مراسل AAV6-hPLAP في الخلايا في مجموعة من تركيزات الجينوم الفيروسي. منح تعدد العدوى من 15،000 تلوين لوحة 36 ٪ وتم اختياره كجرعة فيروسية مثالية.

يعرض التحليل التمثيلي العلاقة بين التلوين وتعدد العدوى. تم الحصول على أعلى تركيز تم اختباره ولم يؤثر على العلاقة الخطية بين التلوين والتركيز الفيروسي. أظهرت دراسة تحييد النشاط على جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل AAV6 ضد الفيروس المرتبط بالغدة الدرقية أو AAV6 عند تخفيف log 10 تثبيطا بنسبة 50٪ لنقل AAV6 أو TI50 بتركيز 10 نانوغرام لكل ملليلتر.

في الأجسام المضادة المحايدة أو فحص NAb ، اختلفت درجة تحييد AAV داخل مجتمع العينة الساذج مع قيم عيار TI50 التي تتراوح من 1/2 إلى 1/80. أشارت نتائج الفحص إلى أن قيم عيار تثبيط AAV TI50 قبل إعطاء AAV تراوحت من 1/4 إلى 1/80. بعد إدارة AAV ، زاد عيار TI50 إلى ما بين 1/2000 وأكبر من 1/32،000 ، مما يدل على تباين واضح في قيم العيار بين إدارة AAV قبل وبعد AAV.

عند التقاط صور للآبار ، من المهم استخدام نفس إعدادات المجهر باستمرار طوال الفحص والتأكد أيضا من التقاط الصور مباشرة في وسط الآبار.