طريقة قوية لإنتاج الكرويات على نطاق واسع لتطبيقات الفحص والتحليل عالية المحتوى
ديسمبر 28, 2021
يفصل هذا البروتوكول طريقة لإنتاج ثلاثة أنواع مختلفة من الكرويات بطريقة تجعلها مناسبة للفحص والتحليل عالي المحتوى على نطاق واسع. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم أمثلة توضح كيف يمكن تحليلها على مستويات الخلايا الكروية والفردية.
يوفر هذا البروتوكول طريقة لإنتاج عدة مئات من الكرويات السرطانية متعددة الخلايا في كل بئر من صفيحة بئر متعددة مناسبة للفحص المجهري الآلي. يمكن تصنيف الكروية المنتجة إلى فئات مختلفة الحجم ، ويمكن استخراج المعلومات دون الخلوية من كل خلية. تنتج هذه التقنية أمصال كافية يمكن استخدامها في الفحص المباشر ودراسات تداخل الحمض النووي الريبي.
قم بتخفيف مادة الطابق السفلي ECM في وسط خال من المصل الأحمر البارد باستخدام أطراف مبردة مسبقا محفوظة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أراهن على 15 ميكرولتر من مادة الطابق السفلي ECM والحل المتوسط في لوحة تصوير 96 بئرا. قم بالطرد المركزي للصفيحة لمدة 20 دقيقة بسرعة 91 مرة G عند أربع درجات مئوية.
احتضن الطبق لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضف رحلات و EDTA إلى الخلايا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في نهاية الحضانة ، نقوم بتعليق الخلايا في وسط كامل يحتوي على 10٪ FBS.
ماصة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية ، في غرفة عد مقياس الدم. احسب عدد الخلايا في أربعة أرباع الغرفة. ينظر سنترا إلى الخلايا عند 135 مرة G لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة.
واحدة من هذه الخلايا يتم تكويرها ، وشفط supernatant وإعادة تعليق الخلايا في وسط كامل خال من الفينول الأحمر للحصول على تركيز 10 إلى ست خلايا لكل ملليلتر. تمييع الخلايا في وسط كامل خال من الفينول الأحمر. انظر الخلايا بقطرة في حركة دائرية بحجم إجمالي قدره 35 ميكرولتر لكل بئر.
احتضن الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. عند 1.2 ميكرولتر من مادة الطابق السفلي ECM إلى 23.8 ميكرولتر من الفينول الأحمر الخالي من الوسط الكامل لكل بئر ، مما يؤدي إلى حجم نهائي قدره 60 ميكرولتر لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي ، استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر من الوسط الكامل الخالي من الفينول الأحمر الطازج. أدخل صفيحة البئر 96 التي تحتوي على كرويات في مجهر فحص عالي المحتوى متحد البؤرة. حدد أشعة الليزر المناسبة لإثارة الأرضيات المستخدمة.
احصل على القنوات بالتتابع لتجنب الحديث المتبادل ، وصور الكرويات باستخدام الأهداف المناسبة. لتحليل مورفولوجيا الكرويات ، قم بتقسيم الكرويات بناء على FLoid المترافق مع الفلورسنت والتلطيخ. قم بتقسيم النوى بناء على سداسي عشري ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين من التلطيخ.
قسم السيتوبلازم لكل خلية بواسطة السداسي المتبقي ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين ، وصمة عار موجودة في سيتوبلازم الخلية. حساب الخصائص المورفولوجية المختلفة للكرويات بما في ذلك الحجم ومساحة السطح والكروية وعدد النوى لكل كرويات. لدى روس صور إضافية لإزالة الكرويات الأصغر من 75 ميكرومتر مكعب وأكبر من 900،000 ميكرومتر مكعب.
لتحليل خلية واحدة داخل الكرويات، قم بتقسيم الكرويات بناء على تلطيخ كروي مترافق مع الفلورسنت. قم بتقسيم النوى بناء على سداسي عشري ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين من التلطيخ. قم بتقسيم السيتوبلازم لكل خلية بواسطة السداسي المتبقي ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، وصمتين موجودتين في سيتوبلازم الخلية.
قسم الليزوسومات على أساس تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية. حساب الخصائص المورفولوجية المختلفة للخلايا داخل كل كروية، بما في ذلك عدد الليزوسومات لكل خلية وحجم الخلية ومساحة سطح الخلية. يوضح الشكل لمحات عامة جيدة عن ثلاثة أنواع مختلفة من الكرويات ، بما في ذلك الصور في مستويات مختلفة متحدة البؤرة.
كما يتم عرض منظر حجمي للكرويات بأكملها. يوضح الشكل عملية تجزئة الأس الهيدروجيني ، وتعرض اللوحة A الكرويات بأكملها في عرض حجمي. تعرض اللوحة B التقسيم المحدد للسيتوبلازم والنوى والليزوسومات داخل جميع خلايا كروية واحدة.
يتم تقسيم السيتوبلازم والنوى على أساس سداسي عشري ثلاثة ، ثلاثة ، ثلاثة ، أربعة ، اثنين من التلطيخ. ويتم تقسيم الليزوسومات بناء على تلطيخ الأجسام المضادة للمختبر المضاد واحد. تعرض اللوحات C نفس المقطع مثل اللوحة B، ولكن في عرض عادي ثلاثي.
يمكن إجراء قياسات مورفولوجية مختلفة على مستوى الكرويات. وتشمل هذه القياسات حساب عدد النوى لكل كروية، فضلا عن هذه السعادة والحجم ومساحة سطح الرقم الهيدروجيني. الحجم النموذجي لكل خلية في الأنواع الكروية الثلاثة.
وكذلك عدد الليزوسومات لكل خلية موضحة في هذا الشكل. يعد تحسين كثافة المقاعد الأولية للخلايا في بداية جيل SP خطوة حاسمة. يوضح الشكل أن إضافة عدد كبير جدا من الخلايا لا يزال يسمح بتكوين الكرويات.
ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي هذا إلى الانصهار إذا كانت كروية. يمكن أن تخضع الكرويات التي تنتج بهذه الطريقة للتحليل النسخي والبروتيني. تستخدم هذه التقنية للتحليل الكمي لامتصاص توصيل الأدوية مثل هذه الجسيمات النانوية وتقييم سميتها للخلايا الفردية في الكرويات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول تقنية لتوليد كرويات ورمية متعددة الخلايا في شكل لوحة متعددة الآبار، ومناسب للفحص عالي المحتوى. يمكن تحليل الكرويات على مستوى الخلايا الفردية وعلى المستوى الجماعي، مما يسمح بتقييمات مورفولوجية مفصلة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- بيولوجيا الخلية
- الفحص المجهري
- الفحص عالي المحتوى
الخلفية
- إنتاج الكرويات متعددة الخلايا للتحليل الآلي
- أهمية تصنيف الحجم والدراسات المورفولوجية
- التطبيقات المحتملة في توصيل الأدوية وتقييمات السمية الخلوية
الطرق المستخدمة
- زرع الخلايا في آبار مغلفة ب ECM
- استخدام الفحص المجهري الليزري confocal للتصوير
- التلطيخ الفلوريسنت لفصل الكرويات والخلايا
النتائج الرئيسية
- تبرهن على تكوين الكرويات الفعال عبر فئات الحجم المختلفة
- تحديد كمي لمورفولوجيا الكروية بما في ذلك الحجم ومساحة السطح وعدد الأنوية
- القدرة على التحليلات النسخة الوراثية والبروتيومية
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة طريقة قوية لتكوين الكرويات وتحليلها.
- تسهم النتائج في تقدم التحليل عالي الإنتاجية في البحوث الخلوية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Large-scale, reproducible production of multicellular spheroids enables high-content screening (HCS) and analysis (HCA) workflows that more accurately model tissue-like environments. This capability addresses the translational gap between traditional monolayer assays and in vivo biology, supporting predictive confidence in early drug discovery and mechanistic de-risking. The method's compatibility with automated imaging and quantitative phenotypic analysis positions it as a critical asset for portfolio triage and lead prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in 3D, tissue-relevant systems.
- Supports functional target validation by quantifying phenotypic responses at both spheroid and single-cell levels.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing detailed morphological and subcellular analysis.
- Improves predictive confidence for downstream compound selection.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-throughput-compatible spheroid production for robust assay development.
- Delivers reproducible quantitative outputs, including volume, surface area, and cell count per spheroid.
- Enables scalable screening of drug candidates and RNA interference studies in physiologically relevant models.
- Supports platform reuse across multiple cell lines and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling, particularly in oncology and drug delivery research.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting transcriptomic and proteomic analyses.
- Provides quantitative endpoints for risk-adjusted advancement decisions.
- Enhances translational biomarker discovery through high-content phenotypic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, supporting both screening and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in 3D multicellular contexts.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible spheroids for high-throughput compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative morphological and subcellular measurements for robust comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and disease-relevant modeling for preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized workflow adaptable across cell types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes spheroid production and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with improved biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and high-content imaging analysis.
- Needs access to confocal microscopy and automated image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell seeding density and imaging protocols.
- Adaptable to multiple cell lines but may require optimization for specific models.
- Initial cell density is critical to prevent spheroid fusion and ensure assay consistency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Coating 96-Well Plate with ECM Basement Material
1:07
Subculturing and Cell Counting
1:52
Seeding Cells into ECM Basement Material-Coated Plates
2:41
Image Acquisition of Spheroids
3:07
Image Acquisition of Spheroids
4:35
Results: Observation and Imaging of Spheroids
6:07
Conclusion
