الكشف عن تراكم الفجوات بعد التكرار وإصلاحها في الخلايا البشرية باستخدام فحص ألياف الحمض النووي
February 3rd, 2022
هنا نصف تعديلين لفحص ألياف الحمض النووي للتحقيق في فجوات الحمض النووي المفردة في تكرار الحمض النووي بعد تحريض الآفة. يتيح فحص الألياف S1 الكشف عن الفجوات اللاحقة للتكرار باستخدام endonuclease S1 الخاص ب ssDNA ، في حين يسمح فحص ملء الفجوات بالتصور وتحديد كمية إصلاح الفجوة.
يفتح بروتوكولنا إمكانيات جديدة للتحقيق في كيفية حدوث النسخ المتماثل على الحمض النووي التالف. يمكن للتقنيات الكشف عن تكوين وإصلاح فجوات الحمض النووي المفردة ، مقابل آفة الحمض النووي. يشق نوكلياز S1 الحمض النووي الأحادي الخيط ويسمح باكتشاف الفجوات اللاحقة للتكرار.
تم استخدام هذا النهج لأول مرة من قبل Dr.Meneghini و Dr.Cordiero-Stone في 1970s في البرازيل ، وتم تكييفه مؤخرا من قبلنا لفحص ألياف الحمض النووي. إن استخدام التقنية الموصوفة هنا لدراسة تكوين وإصلاح الفجوات اللاحقة للتكرار يمكن أن يوفر رؤى ثاقبة حول آلية إصلاح الحمض النووي واستجابة الإجهاد المتماثل التي تحافظ على سلامة الجينوم. بالنسبة لكلا البروتوكولين الموصوفين هنا ، ألياف S1 وفحوصات سد الفجوات ، من الأهمية بمكان تضمين جميع عناصر التحكم لضمان التفسير الدقيق للبيانات.
سيتم عرض الإجراء من قبل Davi J.Martins ، طالب الدكتوراه من مختبرنا ، والدكتورة Annabel Quinet ، وهي متعاونة طورت سابقا هذه التقنيات عند العمل في مجموعتنا. بادئ ذي بدء ، قم بشفط وسائط الثقافة وأضف على الفور وسائط الثقافة مع 20 ميكرومولار من وسائط IDU إلى الخلايا. احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة بالضبط.
ثم ، اغسل الخلايا بسرعة باستخدام PBS المسخن مسبقا مرتين وقم بتشعيعها ب 20 جول لكل متر مربع UV-C. استخدم الخلايا غير المعالجة كعناصر تحكم. أضف على الفور الوسائط التي تحتوي على 200 ميكرومولار CldU إلى الخلايا واحتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 60 دقيقة على وجه التحديد.
بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام PBS المسخن مسبقا مرتين وتغلغل فيها باستخدام المخزن المؤقت CSK 100 لمدة دقيقتين إلى 10 دقائق وفقا لخط الخلية في درجة حرارة الغرفة. بعد نفاذية CSK ، يمكن رؤية النوى التي لا تحتوي على أي سيتوبلازم تقريبا مقارنة بتلك التي كانت قبل النفاذية. صب PBS بعناية أسفل جانب كل بئر لغسل النوى مع PBS.
ثم اغسل النوى باستخدام المخزن المؤقت S1. احتضان النوى في المخزن المؤقت S1 مع 20 وحدة لكل ملليلتر S1 nuclease ، وبدون نوكليز S1 ، لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت S1 وأضف 0.1٪ BSA في PBS.
كشط النوى ونقلها إلى أنبوب مشروح تقريبا 1.5 ملليلتر. حافظ على الأنابيب على الجليد طوال الوقت. الطرد المركزي للنوى في حوالي 4،600 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
أعد تعليق الكريات في PBS بتركيز حوالي 1،500 خلية لكل ميكرولتر. ضع الأنابيب على الجليد وانتقل على الفور إلى إعداد ألياف الحمض النووي عن طريق نشر البروتوكول. قم بتعليق شرائح المجهر بقلم رصاص كربوني وضعها مسطحة على صينية.
اضغط على الجزء السفلي من الأنبوب لضمان التجانس وإضافة ميكرولترين من الخلايا في الجزء العلوي من الشريحة المقابلة. أضف ستة ميكرولترات من مخزن التحلل العازل وقم بتحليل الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حوالي خمس مرات. استخدم طرف الماصة لسحب القطرة قليلا نحو أسفل الشريحة واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحليل النوى.
قم بإمالة الشريحة عند حوالي 20 إلى 40 درجة واسمح للانخفاض بالانتشار إلى أسفل الشريحة بسرعة منخفضة ثابتة. اترك الشريحة لتجف في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم اغمرها في جرة تحتوي على محلول التثبيت الطازج واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الحمض النووي على الشرائح.
اغسل الشرائح باستخدام PBS مرتين لمدة خمس دقائق وقم بتشويه الحمض النووي باستخدام حمض كلوريدريك 2.5 من الأضراس الطازج لمدة 40 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق وقم بحظرها بنسبة 5٪ BSA التي تم تسخينها مسبقا لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اضغط برفق على الورق لإزالة السائل الزائد من الشرائح.
أضف 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية إلى الشرائح بقطرة وضع شريحة غطاء في الأعلى. احتضان لمدة 1 إلى 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة ورطبة. ضع الشرائح في وعاء مع PBS لمدة دقيقة إلى دقيقتين ثم قم بإزالة زلات الغطاء بعناية.
اغسل PBST في جرة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق وضع الشرائح في PBS. قم بإزالة السائل الزائد عن طريق النقر بلطف على ورقة وإضافة 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية إلى الشرائح بقطرة. ضع شريحة غطاء في الأعلى.
احتضان لمدة 45 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة ورطبة. كرر خطوات غسل الشرائح وإزالة PBS الزائدة مرة أخرى وإضافة 20 ميكرولتر من كاشف التركيب إلى الشرائح. ضع غطاء في الأعلى وتجنب الفقاعات.
ضع قطرة من زيت الغمر بالقرب من الجزء العلوي من الشريحة حيث تم تحليل الخلايا. استخدم القناة الخضراء وابحث عن النقاط الخضراء في الخلفية للعثور على التركيز. افتح برنامج Leica Application Suite ، وانقر فوق اكتساب ، وحدد القناة الخضراء.
اضبط إعدادات القناة الخضراء قبل التحليل. بعد ذلك ، قم بالتغيير إلى القناة الحمراء واضبط الإعدادات. ابحث عن التركيز الرئيسي للألياف وانتقل إلى الحواف للعثور على الألياف الفردية المنتشرة جيدا وغير المتداخلة.
استخدم قناة واحدة فقط لتحديد المناطق للصور وتجنب التحيز المحتمل. انقر على أيقونة الحصول على تراكب واضبط البرنامج لتكبير المجهر الصحيح. التقط حوالي 15 إلى 20 صورة لكل شريحة إلى جانب الشريحة بأكملها في القناة الخضراء ثم في القناة الحمراء.
يتم الآن دمج القناتين ويتم نقل التراكب الذي تم إنشاؤه إلى مجلد فريد. من الممكن رؤية الألياف ذات الألوان الحمراء والخضراء. افتح برنامج ImageJ ، وانقر بزر الماوس الأيسر على الرمز الخامس ، وحدد الخيار الثاني ، ثم حدد أداة الخط المجزأ.
انقر بزر الماوس الأيسر لرسم المسار الدقيق للمسار الأحمر أو الأخضر وانقر بزر الماوس الأيمن لإيقاف الرسم. اضغط على الزر M على لوحة المفاتيح لقياس الطول. بالنسبة لألياف S1 ، تتبع قياسات المسالك الحمراء والخضراء لكل ألياف وقم بقياس أطوال المسالك الحمراء والخضراء من 150 ليفا على الأقل من صور مختلفة.
تظهر ألياف S1 في هذه الصور التمثيلية. يظهر هنا مسار الحمض النووي الناشئ المتحكم فيه بدون الفجوات والمنيع للانقسام بواسطة نوكليز S1. أدى مسار الحمض النووي الإيجابي للفجوات المشقوقة بواسطة نوكليز S1 إلى طول مسار CldU أقصر.
يمكن تنفيذ مخطط وضع العلامات التفاضلية الموصوف على نطاق واسع في مخطوطة النص لتسمية أحداث ملء الفجوات. في هذا الفحص ، المسمى فحص ملء الفجوات ، تتوافق مسارات IDU الأطول مع تصحيح CldU واحد على الأقل أو عدد أقل من بقع CldU مع كثافة منخفضة لملء الفجوة. وتتوافق مساحات IDU الأقصر ، مع رقعة CldU واحدة على الأقل ، ومساحات IDU الأطول مع المزيد من بقع CldU ، مع كثافة عالية لملء الفجوة.
تعد خطوة النفاذية لهذا البروتوكول أمرا بالغ الأهمية بالنسبة لنوكليز S1 للعمل على الفجوات التي تشكلت أثناء تكرار الحمض النووي التالف. يمكن أيضا استخدام نوكليز S1 في بروتوكول فحص المذنب للكشف عن الفجوات التي تشكلت أثناء تكرار الحمض النووي التالف الذي يستمر بعد العلاج. مهد فحص الألياف S1 الطريق للنموذج الجديد الذي يمكن أن تسبب الفجوات اللاحقة للتكرار قابلية الإصابة بالسرطان ، خاصة في سرطانات الثدي والمبيض التي تحمل طفرات في جينات BRCA1 و 2.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة تعديلين على تحليل ألياف الحمض النووي لدراسة الفجوات أحادية الشريط في الحمض النووي المضاعف بعد تحريض الآفة. يكتشف تحليل ألياف S1 الفجوات ما بعد النسخ باستخدام إندولياز S1 المحدد لـ ssDNA، بينما يصور تحليل ملء الفجوات ويحدد كميًا إصلاح الفجوات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- آليات إصلاح الحمض النووي
- استجابة إجهاد النسخ المتماثل
- السلامة الجينومية
الخلفية
- إن تكوين وإصلاح الفجوات أحادية الشريط في الحمض النووي أمر حاسم للحفاظ على سلامة الجينوم.
- وضعت الأعمال السابقة في السبعينيات الأساس لهذه التحليلات.
- يمكن أن يوفر فهم هذه العمليات رؤى حول نسخ الحمض النووي على الحمض النووي التالف.
- الضوابط الدقيقة ضرورية لتفسير النتائج من هذه التحليلات.
غرض الدراسة
- للتحقيق في كيفية حدوث النسخ على الحمض النووي التالف.
- لكشف تكوين وإصلاح الفجوات أحادية الشريط في الحمض النووي.
- لتعزيز فهم آليات إصلاح الحمض النووي واستجابات إجهاد النسخ المتماثل.
الطرق المستخدمة
- تحليل ألياف S1 لكشف الفجوات ما بعد النسخ.
- تحليل ملء الفجوات لتصوير وتحديد كميًا إصلاح الفجوات.
- تضمين الضوابط الضرورية لتفسير البيانات بدقة.
- تكييف التقنيات التاريخية إلى التحليلات الحديثة.
النتائج الرئيسية
- الكشف الناجح عن الفجوات أحادية الشريط في الحمض النووي باستخدام تحليل ألياف S1.
- تحديد كمي لإصلاح الفجوات من خلال تحليل ملء الفجوات.
- رؤى حول آليات إصلاح الحمض النووي واستجابة إجهاد النسخ المتماثل.
- تبيان أهمية الضوابط في التصميم التجريبي.
الاستنتاجات
- توفر تحليلات ألياف الحمض النووي المعدلة أدوات قيمة لدراسة نسخ الحمض النووي على القوالب التالفة.
- يمكن أن يفيد فهم الفجوات أحادية الشريط في الحمض النووي في دراسات السلامة الجينومية الأوسع.
- يمكن أن تؤدي هذه التقنيات إلى تقدم في مجال أبحاث إصلاح الحمض النووي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Detection and quantification of post-replicative single-stranded DNA gaps are critical for de-risking early discovery programs targeting genome stability and DNA repair pathways. The modified DNA fiber assay with S1 nuclease enables direct measurement of replication stress responses and repair dynamics, informing target validation and mechanistic confidence in oncology and genome maintenance portfolios. This capability supports predictive assessment of DNA repair liabilities and informs risk-adjusted advancement decisions in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DNA repair mechanisms at replication forks under genotoxic stress.
- Supports functional validation of targets involved in post-replicative gap formation and repair.
- Provides mechanistic de-risking for candidate targets in genome integrity pathways.
- Facilitates predictive confidence in pathway modulation and synthetic lethality strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes robust, quantitative readouts for replication fork dynamics and gap repair events.
- Standardizes detection of ssDNA gaps for reproducible compound screening and profiling.
- Enables assay scalability and platform reuse for evaluating DNA repair modulators.
- Supports reliable assessment of compound effects on replication stress and repair fidelity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of replication stress, particularly in BRCA-deficient cancers.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of DNA repair-targeted agents.
- Enables risk-adjusted go/no-go decisions based on quantitative repair phenotypes.
- Supports translational biomarker development for genome instability signatures.
Pipeline & Workflow Integration
This modified DNA fiber assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum for genome maintenance and oncology programs.
- Discovery Biology: Quantifies post-replicative gap formation and repair, clarifying DNA damage response pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound and genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides tract length measurements and gap-filling quantification for comparative analysis.
- Translational Research: Links mechanistic repair phenotypes to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for ongoing DNA repair and replication stress research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in DNA repair target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Enhances assay standardization, reproducibility, and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in genome stability programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair and replication stress targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DNA fiber assay execution and quantitative image analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy and image processing infrastructure.
- Demands rigorous control inclusion for accurate data interpretation and cross-team comparability.
- Adaptable to various human cell models but may require protocol optimization per system.
- Resolution limited to detection of gaps above a few hundred bases; smaller lesions may remain undetected.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
S1 Fiber Experimental Setup
3:51
DNA Fiber Preparation by Spreading
4:58
Immunostaining of DNA Fibers
6:45
Image Acquisition and Analysis
8:39
Results: Post-Replicative ssDNA Gaps on Ongoing Forks by S1 Fiber Assay and Post-Replicative Repair by Gap Filling
9:42
Conclusion
