نهج في المختبر لدراسة خلل الميتوكوندريا: نموذج Cybrid
مارس 9, 2022
cybrids المتنقلة هي خلايا هجينة يتم الحصول عليها عن طريق دمج الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) - الخلايا المستنفدة (خلايا rho0 ) مع الخلايا الخلوية (الخلايا المنوحة) المشتقة من المرضى المصابين باضطرابات الميتوكوندريا. فهي تسمح بتحديد الأصل النووي أو الميتوكوندريا للمرض ، وتقييم النشاط الكيميائي الحيوي ، وتأكيد الدور الممرض للمتغيرات المرتبطة ب mtDNA.
لا يزال التوليد السيبراني هو أحدث بروتوكول لفهم الدور الممرض لأي طفرة جديدة في الحمض النووي للميتوكوندريا وربط النسبة المئوية للاتروبلاز بشدة المرض. تسمح هذه التقنية بإجراء تحقيق كيميائي حيوي في نظام نووي متجانس ، حيث تكون مساهمة الخلفية النووية للمريض غائبة. تسمح هذه التقنية بالتحقق من صحة الإمراضية لطفرة في الحمض النووي للميتوكوندريا.
ويجعل من الممكن دراسة تأثيره على المستوى الكيميائي الحيوي غسل الأطباق 35 ملم التي تحتوي على الخلايا الليفية مرتين باستخدام ملليلتر من 1X PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. نظف السطح الخارجي للأطباق بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وانتظر حتى يتبخر الكحول. قم بإزالة الأغطية من الأطباق والأغطية اللولبية من الزجاجات.
ضع كل طبق بدون الغطاء رأسا على عقب في الجزء السفلي من كل زجاجة طرد مركزي سعة 250 ملليلتر. أضف ببطء 32 ملليلتر من وسط النوى إلى كل زجاجة مما يسمح للوسط بدخول الطبق وملامسة الخلايا. قم بإزالة أي فقاعات من الأطباق باستخدام ماصة مراعي زجاجية طويلة ، مع تقويس الطرف في لهب بنسن.
أغلق كل زجاجة بغطاء المسمار ، وانقلها إلى جهاز الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 8،000 × G.Aspirate الوسط من الزجاجات والتخلص منه. قم بإزالة الأطباق عن طريق عكس الزجاجات على شاش معقم تم رشه مسبقا بالإيثانول بنسبة 70٪.
نظف السطح الخارجي للأطباق وأغطيتها بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وأغلق الأطباق بعد تبخر الإيثانول. قبل المتابعة تحقق من تكوين cytoplast باستخدام المجهر المقلوب للخلايا الحية. ابحث عن الخلايا الليفية الممدودة للغاية بسبب بثق نواتها التي يسببها السيتوكالاسين.
لكل طبق 35 ملم إضافة 1،000،143 صف صفر خلايا. أعيد تعليقه في ملليلتر من وسط الثقافة مع استكمال 5٪ FBS. اترك الأطباق لمدة ثلاث ساعات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرطبة لتسوية الخلايا الصفرية المكونة من 143 صفا على الأشباح.
بعد ثلاث ساعات من الحضانة ، قم بشفط الوسط والتخلص منه. اغسل خلايا الالتصاق مرتين بملليلتر من وسط الجلوكوز العالي DMEM بدون مصل أو MEM ، ثم قم بشفط الوسط والتخلص منه. أضف 500 ميكرولتر من محلول البولي إيثيلين جلايكول إلى الخلايا واحتضنها لمدة دقيقة واحدة بالضبط.
شفط والتخلص من محلول البولي إيثيلين جلايكول. اغسل الخلايا ثلاث مرات بملليلترين من الجلوكوز العالي DMEM بدون مصل أو مع MEM. أضف ملليلترين من وسط الاندماج ، واحتضن بين عشية وضحاها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
التربسين الخلايا في أطباق الثقافة المتبقية عدها وزرعها في واحد أو أكثر من أطباق بتري أضف 50 إلى 100 خلية لكل طبق في الثقافة المكملة حتى تظهر المستنسخات. ثم دعهم ينمون لعدة أيام. باستخدام مجهر ستيريو ، التقط الحيوانات المستنسخة من طبق بتري باستخدام أسطوانات استنساخ أو طرف ماصة.
حاول تجنب تجميع نسخ مختلفة ونقلها إلى طبق بئر 96 ، يحتوي كل بئر على 200 ميكرولتر من وسط الثقافة المكملة. تم توليد Cybrids بدءا من الخلايا الليفية المشتقة من مريض يحمل M2343A2G غير المتجانسة واحدة من أكثر طفرات الحمض النووي الميتوكوندريا شيوعا المرتبطة باعتلال عضلة الميتوكوندريا ، والحماض اللبني الدماغي ، والنوبات الشبيهة بالسكتة الدماغية. أظهر تحليل عدد متغير من التكرارات الترادفية أن الحمض النووي السيبراني مطابق للخلايا الصفرية التي تؤكد استبدال الحمض النووي السيبراني للمريض بجينوم 143 B.
يمكن استخدام تعدد الأشكال لطول الشظايا المقيدة ، أو تحليلات التسلسل ، لتقييم وجود طفرة الحمض النووي للميتوكوندريا والنسبة المئوية غير المتجانسة. عند محاولة هذا البروتوكول ، من المهم التحقق من الأصل الوراثي الصحيح للحمض النووي للنيوكليون والميتوكوندريا ، وكذلك كمية الحمض النووي للميتوكوندريا في السايبريدات المعاد توطينها.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
السيبريدات الميتوكوندرية المنقولة هي خلايا هجينة يتم إنشاؤها عن طريق دمج خلايا مستنفدة من mtDNA مع سيتوبلاستات مأخوذة من مرضى يعانون من اضطرابات ميتوكوندرية. يساعد هذا النهج في تحديد أصل الأمراض وتقييم الأنشطة البيوكيميائية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- وراثة الميتوكوندريا
خلفية علمية
- تعد الهجائن السيتوبلازمية الميتوكوندرية (Transmitochondrial cybrids) ضرورية لدراسة الاضطرابات الميتوكوندرية.
- وهي تتيح تحليل المساهمات النووية والميتوكوندرية في المرض.
- تعتبر هذه التقنية حاسمة للتحقق من الإمراضية للطفرات في mtDNA.
- إن فهم التأثير الكيميائي الحيوي للطفرات أمر حيوي لإدارة المرض.
الغرض من الدراسة
- للبحث في الدور المرضي لطفرات الحمض النووي الميتوكوندري الجديدة.
- لربط نسبة التغاير البلازمي (heteroplasmy) بشدة المرض.
- لإجراء استقصاءات بيوكيميائية في بيئة نووية مضبوطة.
الطرق المستخدمة
- دمج خلايا rho 0 مع سيتوبلاستات منزوعة النواة.
- مقاييس كيميائية حيوية لتقييم الوظيفة الميتوكوندرية.
- التحقق من طفرات mtDNA من خلال تحليل الخلايا الهجينة (cybrid analysis).
- استخدام PBS والإيثانول لتحضير الخلايا.
النتائج الرئيسية
- النجاح في إنشاء الهجناء السيتوبلازمية (cybrids) عبر نقل الميتوكوندريا.
- تحديد الأنشطة البيوكيميائية المرتبطة بطفرات mtDNA.
- إيجاد ارتباط بين مستويات تباين الميتوكوندريا (heteroplasmy) ونتائج المرض.
- تأكيد الدور الممرض لمتغيرات محددة في mtDNA.
الاستنتاجات
- تعد الهجائن السيتوبلازمية الميتوكوندرية (Transmitochondrial cybrids) فعالة في دراسة الأمراض الميتوكوندرية.
- تعزز هذه الطريقة فهم طفرات mtDNA وتأثيراتها.
- يمكن للأبحاث المستقبلية البناء على هذه النتائج لتطوير علاجات موجهة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح نماذج الهجائن السيتوبلازمية (cybrid) عبر نقل الميتوكوندريا تحليلاً دقيقاً للمساهمات الجينية للميتوكوندريا مقابل تلك النووية في خلل وظيفة الفسفرة التأكسدية (OXPHOS)، والتي تمثل نقطة تحول حرجة في أبحاث أمراض الميتوكوندريا. يوفر هذا النهج تقييماً ميكانيكياً للمخاطر وتحققاً من الأهداف الخاصة بطفرات الحمض النووي للميتوكوندريا، مما يعزز الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكرة والأبحاث الانتقالية. كما أن قدرة نظام الهجائن السيتوبلازمية على عزل وتوصيف الإمراضية تدعم اتخاذ قرارات قائمة على تقييم المخاطر في محافظ برامج اضطرابات الميتوكوندريا.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يُتيح الاستقصاء المباشر للمسببية المرضية لطفرات الحمض النووي الميتوكوندري في خلفية نووية محكومة.
- يدعم التحقق الوظيفي من الهدف من خلال التمييز بين عيوب الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) الناتجة عن mtDNA وتلك الناتجة عن nDNA.
- يسهل تقليل المخاطر الآلية للمتغيرات الميتوكوندرية الجديدة قبل الاستثمار في الدراسات اللاحقة.
- يوفر منصة لربط مستويات التباين الجيني (heteroplasmy) بالأنماط الظاهرية ذات الصلة بالمرض.
الفحص وتطوير المقايسة
- تأسيس سلالات هجينة سيتوبلازمية (cybrid) مُصادق عليها لإجراء مقاييس كيميائية حيوية وجينية قابلة للتكرار.
- تمكين القياس الكمي لنشاط الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) وتأثير الطفرات.
- دعم توحيد المقاييس وقابلية التكرار بين المختبرات في أبحاث الميتوكوندريا.
- تجهيز أنظمة خلوية قوية لفحص المركبات التي تستهدف خلل وظائف الميتوكوندريا.
الأبحاث الترجمية وقبل السريرية
- يربط نماذج الخلايا الهجينة (cybrid) ذات الصلة بالمرض مع تطوير المؤشرات الحيوية الانتقالية.
- يوفر الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف الجيني إلى التحقق قبل السريري من الأهداف الميتوكوندرية.
- يتيح التقدم المدروس للمداخلات المرشحة بناءً على الأدلة الميكانيكية مع تعديل المخاطر.
- يدعم تقليل المخاطر التنبؤي لمحفظة أمراض الميتوكوندريا.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يدمج نموذج الهجين الخلوي (cybrid) في التسلسل الممتد من الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية من خلال تمكين اختبار الفرضيات، والتحقق من الأهداف، وتوضيح الآليات المسببة للاضطرابات الميتوكوندرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضية الصفرية لإمراضية طفرات mtDNA وتوضح الدوافع الجينية لخلل وظائف OXPHOS.
- الفحص: توفر خطوط cybrid قياسية وقابلة للتكرار للمقاييس البيوكيميائية الكمية.
- التحليلات: تقدم قراءات كمية لـ heteroplasmy ونشاط OXPHOS للتحليل المقارن.
- الأبحاث الانتقالية: تربط النتائج الجينية بالتحقق من صحة النماذج قبل السريرية ومواءمة المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر منصة قابلة لإعادة الاستخدام للاكتشاف المستمر للأهداف والمؤشرات الحيوية الميتوكوندرية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في أبحاث أمراض الميتوكوندريا.
- القيمة التشغيلية: توحد عمليات إنشاء وتوصيف الهجناء السيتوبلازمية (cybrids) لضمان القابلية للتكرار والتوسع.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات مدروسة بالاستمرار أو التوقف وإدارة المحافظ الاستثمارية بكفاءة في رأس المال.
- التأثير على المحفظة: تدعم ترتيب الأولويات المعدلة وفقاً للمخاطر والنهوض ببرامج اضطرابات الميتوكوندريا.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في دمج الخلايا، وعلم وراثة الميتوكوندريا، وتطوير المقايسات الكيميائية الحيوية.
- تستلزم الوصول إلى بنية تحتية متخصصة في زراعة الخلايا، والطرد المركزي، والتحليل الجزيئي.
- تتطلب توحيداً صارماً بين الفرق في بروتوكولات إنتاج السايبريد (cybrid) والتحقق من صحتها.
- قد تتطلب تكيفاً مع أنواع مختلفة من الخلايا أو خلفيات وراثية ذات صلة بالمرض.
- يعد التحقق من الأصول الوراثية النووية والميتوكوندرية أمراً ضرورياً لضمان دقة النموذج.
