الاختبار الجيني قبل الزرع لمرض الصبغيات العدلية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات

يقدم هذا البروتوكول الإجراء من تضخيم الخلية الواحدة إلى بيانات الإبلاغ النهائية في الاختبار الجيني قبل الزرع لاختلال الصيغة الصبغية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات. يمكن أن يساعد هذا الإجراء المشاهدين على فهم جيد لسير العمل التجريبي لتسلسل PGT-A وتكرار هذه التقنية في مختبر تشخيصي باستخدام منصة NGS القائمة على أشباه الموصلات. ابدأ بسحب 25 ميكرولتر من منتجات تضخيم الجينوم بأكملها ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر محمل مسبقا ب 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.

دوامة وخلط حبات تنقية الحمض النووي. Aliquot 50 ميكرولتر من هذا الحل في كل أنبوب عينة. دوامة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة خمس ثوان.

اضبط الأنبوب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لعملية ربط الحمض النووي. أدخل أنبوب جهاز الطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر في رف مغناطيسي. ثم انتظر حتى تنجذب جميع الخرز المغناطيسي إلى الجدار الجانبي للأنبوب.

انقل المادة الفائقة بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر. تجنب سحب الخرز. وفقا لحجم العينة الأصلي.

ماصة 30 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي والدوامة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة خمس ثوان. اضبط الأنبوب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لعملية ربط الحمض النووي. أدخل أنابيب أجهزة الطرد المركزي مقاس 1.5 ملم في الرف المغناطيسي.

ثم ، انتظر حتى تنجذب جميع الخرز المغناطيسي إلى الجدار الجانبي للأنبوب. قم بإزالة والتخلص بعناية من supernatant. تجنب سحب الخرز.

ماصة 300 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. ثم قم بتدوير الأنبوب برفق مرتين بزاوية 180 درجة وحرك الخرز على طول جدار الأنبوب لغسل شامل. ماصة وتجاهل supernatant.

تجنب سحب الخرز. كرر إجراء الغسيل مرة واحدة. ضع لوحة تضخيم جديدة في النظام بمجرد اكتمال البرنامج النظيف.

أدخل أنابيب التجميع ، كل منها مملوء مسبقا ب 150 ميكرولتر لكسر المحلول الثاني في الدوار ، ثم ضع الجسر على أنابيب التجميع. أضف زيت التفاعل إلى نصف الأنبوب ومحلول كسر المستحلب إلى ثلث الأنبوب. ضع مرشحا جديدا لإعداد القالب على رف أنبوب مع وضع مدخل العينة لأعلى.

دوامة الحل لمدة خمس ثوان وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة خمس ثوان. ثم انقل المحلول إلى بوابة عينة المرشح بعد سحب 800 ميكرولتر ثلاث مرات. جهاز طرد مركزي للأنبوب لتقليل الفقاعات قبل الحقن الأخير.

تجنب حقن الهواء في الفلتر. حقن 200 ميكرولتر من زيت التفاعل اثنين ، بعد المحلول المختلط. اقلب بوابة العينة الخاصة بالفلتر لأسفل واستبدل تكيف الغسيل بالفلتر.

أدخل إبرة العينة في الفتحة المركزية لغطاء الدوار ثم اضغط على الإبرة في الأسفل. انقر فوق الزر "تشغيل" على الشاشة واختر البرنامج وفقا للمجموعة المقابلة. ثم حدد مساعدة للتحقق من جميع الخطوات.

انقر فوق التالي حتى يبدأ التشغيل. سيستغرق الجري حوالي 4.5 ساعة حتى ينتهي. حدد التالي عند انتهاء البرنامج.

سيبدأ النظام عملية طرد مركزي مدتها 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، انقر فوق الزر فتح الغطاء وحرك أنابيب التجميع إلى الرفوف. إذا لم ينتقل الإجراء إلى الخطوة التالية في غضون 15 دقيقة ، فاضغط على الدوران النهائي لإعادة الطرد المركزي.

قم بإزالة supernatant في أنبوب التجميع ، مع ترك 100 ميكرولتر من المحلول في الأنبوب. امزج العينة المتبقية عن طريق السحب وانقل العينة إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد الذي تبلغ سعته 1.5 ملليلتر والذي يحمل علامة OT. عند سحب السوبرناتانت، تجنب لمس الجزء السفلي من الأنبوب على طول الجانبين. ماصة 100 ميكرولتر من الماء الحر نوكليز في كل أنبوب تجميع ونقل الحل إلى أنبوب OT غسلها عن طريق السحب المتكرر.

أضف 600 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز إلى أنبوب OT لتكوين الحجم الإجمالي البالغ ملليلتر واحد. دوامة لمدة 30 ثانية في جهاز الطرد المركزي في 15 ، 500 مرة G لمدة ثماني دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت بلطف تاركا 100 ميكرولتر من المحلول في أنبوب OT.

استخدم الطرف للتخلص من طبقة الزيت تماما. أضف 900 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز ، دوامة لمدة 30 ثانية وأجهزة طرد مركزي عند 15،500 مرة G لمدة ثماني دقائق. قم بإزالة supernatant حتى يبقى 20 ميكرولتر من المحلول وأضف حل تعليق القالب لتكوين حجم 100 ميكرولتر.

ثم دوامة لمدة 30 ثانية ولفترة وجيزة أجهزة الطرد المركزي لمدة ثانيتين. انتقل إلى الخطوة التالية في غضون 12 ساعة من معالجة العينات قم بتحميل 100 ميكرولتر من المكتبة المخففة ، و 130 ميكرولتر من حبات C1 ، و 300 ميكرولتر من محلول غسل القالب x x ، و 300 ميكرولتر من محلول الذوبان إلى شرائط الآبار الثمانية. قم بتثبيت شرائط الآبار الثمانية على وحدة التخصيب ، وقم بتحميل طرف السحب ، واضبط أنبوب الطرد المركزي سعة 200 ميكرولتر في موضع التجميع.

انقر فوق ابدأ لتشغيل البرنامج. ماصة 55 ميكرولتر من محلول العينة وحقنها في ثقب عينة الشريحة. اضبط الشريحة على جهاز الطرد المركزي.

احتفظ بالشق نحو الخارج وبوابة العينة في الداخل. ثم قم بموازنته مع شريحة أخرى مستخدمة وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق. قم بإعداد حل التحميل كما هو موضح في مخطوطة النص.

نفخ 100 ميكرولتر من الهواء في محلول الرغوة. قم بتميض المحلول بشكل متكرر حتى تصبح الفقاعات في حالة رغوة كثيفة وحافظ على حجم الرغوة إلى حوالي 250 ميكرولتر. ضع الشريحة على المقعد بعد جهاز الطرد المركزي.

حقن 100 ميكرولتر من الرغوة في ثقب العينة وإزالة المحلول المبثوق في البوابة الخارجية. ثم ، الطرد المركزي للرقاقة لفترة وجيزة لمدة 30 ثانية. كرر هذه العملية مرة واحدة.

حقن 100 ميكرولتر في 50٪ غسل المخزن المؤقت مرتين وإزالة المحلول المبثوق في البوابة الخارجية بعد كل حقن. ثم حقن 100 ميكرولتر في 50٪ من المخزن المؤقت التلدين ثلاث مرات وإزالة المحلول المبثوق في البوابة الخارجية بعد كل حقنة. حقن 65 ميكرولتر في 50٪ من المخزن المؤقت لتفاعل الإنزيم ، وتجنب الفقاعات وإزالة المحلول المبثوق في البوابة الخارجية.

قم بتثبيت الشريحة المحملة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق وقم بتثبيت الشريحة على بوابة رقاقة التسلسل. اختر البرنامج المخطط تحقق من المعلومات وابدأ التشغيل. حصل التشغيل التمثيلي على ما مجموعه 17.6 غيغابايت من البيانات وكان معدل التحميل الإجمالي لجسيم الكرة الأيونية 88٪ في إجمالي آبار الشريحة.

أكدت الخريطة الحرارية حتى تحميل العينة على إجمالي مساحة الشريحة. 77٪ من إجمالي القراءات كانت قابلة للاستخدام. أظهرت جميع الآبار المحملة بمزود خدمة الإنترنت إثراء القوالب بنسبة 100٪ حيث كانت 78٪ نسلية.

من بين جميع القوالب النسيلة ، تم تأهيل 97٪ كمكتبة نهائية. كان متوسط طول القراءة 177 زوجا أساسيا بينما كان الوسيط والوضع 176 و 174 زوجا أساسيا ، على التوالي. كانت الأعداد القصوى للثيمين والسيتوزين والأدينين في القوالب حوالي 76 على خط القطع المؤهل البالغ 50.

وفي جميع الآبار القابلة للعنونة التي تضم مزودي خدمات الإنترنت المباشرين، تمت تصفية 99.5 في المائة من المكتبات المبنية و 20 في المائة من المكتبات المتعددة النسيلة والمنخفضة الجودة في حين تم تأهيل 76.6 في المائة من مقدمي خدمات الإنترنت لمزيد من التحليل. أظهرت نتيجة تباين عدد النسخ من عينة واحدة 182.16 زوجا من الفسيفساء الصبغية من P 16.3 إلى Q 35.2 على الكروموسوم أربعة وأزواج أحادية القاعدة من 33 نقطة 13 من الجزء الأحادي من Q 11.1 إلى Q 13.33 على الكروموسوم 22. عند إجراء اختيار الشظايا ، يجب تعديل الفترات الزمنية بين الخطوات وفقا لحجم العينات في نفس الدفعة لمنع التعرض الزائد ونقص العينات الأمامية والخلفية.