استكشاف التفاعل الجزيئي الحيوي بين Molecular Chaperone Hsp90 وبروتين العميل Kinase Cdc37 باستخدام تقنية الاستشعار الحيوي ذات التأثير الميداني

FEB هي منصة للكشف عن التفاعل خالية من الملصقات وفعالة من حيث التكلفة _ توفر قياسات سريعة ودقيقة. توفر هذه الطريقة التحقق من صحة التفاعلات المعروفة أو غير المعروفة وطريقة سهلة لاختبار المثبطات المحتملة للتفاعلات الجزيئية الحيوية. الميزة الرئيسية ل FEB هي برنامجها الآلي سهل الاستخدام الذي يخطر المستخدم طوال التجربة باستخدام منصة سحب يدوية مفتوحة ، مما يتيح للمستخدمين العمل مع القليل من التدريب أو حتى بدون تدريب.

تقدم تقنية FEB أيضا تطبيقات في مجالات متنوعة من المستحضرات الصيدلانية ، والتحليل الجزيئي الحيوي للجزيئات الصغيرة ، والببتيدات والبروتينات ، والتحقق من صحة الأدوية عن طريق ترجمة النشاط البيولوجي في المختبر بسهولة إلى فعالية في الجسم الحي. كونك مبتدئا ، قد تواجه تحديات في اختيار تركيزات التحليل المناسبة لتحسين التجربة للحصول على قيمة دينار كويتي موثوقة. ننصح بإيلاء الاهتمام لعملية تشغيل الشريحة وتبادل المخزن المؤقت المناسب.

ابدأ بخلط كميات متساوية من محلول EDC و sulfo-NHS عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ضع شريحة الاستشعار الحيوي التي توفرها الشركة في طبق بتري زجاجي مع غطاء مجهز. يقترح أن تتم جميع خطوات التشغيل الوظيفية التي ينطوي عليها تنشيط الرقاقة داخل طبق Petri.

ضع 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت MES أحادي المولي على شريحة المستشعر الحيوي. احتضان لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت وتطبيق 50 ميكرولتر من محلول EDC sulfo-NHS على الفور على شريحة الاستشعار.

يغطى طبق بتري ويحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشق محلول EDC sulfo-NHS من الشريحة وطبق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت MES ذو المولي الواحد. قم بشفط MES المخزن المؤقت وشطف الشريحة مرتين باستخدام 50 ميكرولتر من 1X PBS.

استنشق PBS من الشريحة وأضف الجزيء المستهدف Hsp90. قم بتغطية طبق بتري الزجاجي واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم ، استنشق المحلول الذي يحتوي على الجزيء المستهدف وشطفه ثلاث مرات باستخدام 50 ميكرولتر من 1X PBS.

استنشق محلول 1X PBS من الشريحة وأضف 50 ميكرولتر من محلول التبريد الواحد. يغطى طبق بتري الزجاجي ويحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشاق محلول واحد من الشريحة وإضافة 50 ميكرولتر من محلول التبريد اثنين.

يغطى طبق بتري الزجاجي ويحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بشفط محلول التبريد من الشريحة وشطف الشريحة خمس مرات باستخدام 50 ميكرولتر من 1X PBS تاركا آخر قطرة PBS على المستشعر. قم بإعداد سلسلة التخفيف التحليلي ل Cdc37 في نطاق التركيز المطلوب.

صمم التجربة لتشمل ما لا يقل عن ثمانية تركيزات تحليلية مختلفة للحصول على ثابت تفكك موثوق به ، أو قيمة KD ، وإعداد هذه التخفيفات المختلفة في نفس المخزن المؤقت المستخدم في المعايرة والبروتين المستهدف. ضع الشريحة بعناية على الأداة. تأكد من تشغيل البرنامج وتحول ضوء LED إلى اللون الأخضر.

بعد ذلك ، اضغط على وحدة Run Experiment النمطية على البرنامج الآلي واختر 10 نقاط مع التجديد أو أي بروتوكول آخر مطلوب. املأ التفاصيل مثل اسم المشغل واسم التجربة والتاريخ والمخزن المؤقت للتجديد والهدف المعطل والتحليل في الحل. اضغط على الزر بدء التجربة المعروض على البرنامج واتبع الإرشادات التي يعرضها البرنامج التلقائي.

لإجراء معايرة الأداة، قم بشفط محلول PBS المتبقي من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمعايرة. اضغط على الزر Continue (متابعة) وانتظر لمدة خمس دقائق حتى تنتهي خطوة المعايرة. يعرض البرنامج نقطة النهاية المحددة لخطوة المعايرة مع إنذار تحذير للمتابعة.

بعد ذلك ، قم بإجراء ارتباط تحليلي عن طريق شفط مخزن المعايرة المؤقت من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من أدنى تركيز تحليلي. اضغط على الزر Continue (متابعة) وانتظر لمدة خمس دقائق حتى تنتهي خطوة الاقتران. يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة الاقتران مع إنذار تحذير للمتابعة.

لإجراء فصل تحليلي ، استنشق محلول التحليل من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانفصال. اضغط على زر متابعة. بعد مدة خطوة الانفصال ، يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة الانفصال مع إنذار تحذير.

بعد ذلك ، قم بإجراء تجديد الرقاقة عن طريق شفط محلول التفكك من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من مخزن التجديد. ثم اضغط على الزر متابعة. تستغرق خطوة التجديد عادة حوالي 30 ثانية حتى تنتهي.

بعد ذلك ، يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة التجديد مع إنذار تحذيري للمتابعة. أخيرا ، لغسل الشريحة ، قم بشفط محلول التجديد من الشريحة وتطبيق 50 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت. استنشق المحلول من الشريحة وكرر ذلك خمس مرات.

اترك آخر قطرة من المخزن المؤقت للغسيل على الشريحة. ثم اضغط على الزر Continue (متابعة) وانتظر لمدة 30 ثانية حتى تنتهي مدة خطوة الغسيل في شاشة البرنامج. كرر الخطوات لكل تركيز تحليل مستخدم.

تشكل الخطوات الخمس للمعايرة وتحليل الارتباط والتفكك والتجديد والغسيل خمس مرات دورة واحدة. اضغط على زر التحليل في برنامج التحليل الآلي في نهاية التجربة. ستظهر نافذة عرض تحتوي على جميع النقاط التجريبية.

تأكد من صحة تركيزات التحليل المستخدمة في البروتوكول المحدد. اضغط على زر تشغيل التحليل لإنشاء قيمة الدينار الكويتي تلقائيا. يقوم البرنامج بإنشاء مخطط مناسب للتلة عن طريق رسم تركيزات التحليل مقابل استجابات I-Id المقابلة التي يتم من خلالها حساب ثابت التفكك عند التوازن.

تم تجميد البروتين المستهدف Hsp90 إلى الشريحة ، وبالنسبة للتجربة الأولى ، تم إعداد 10 تركيزات من البروتين التحليلي Cdc37 تتراوح من 25 نانومولس إلى 5000 نانومول. تم عرض ملفات البيانات التي تم إنشاؤها من التجربة الأولى هنا. يتم عرض البيانات التجريبية التي تم رصدها في الوقت الفعلي هنا.

يتوافق المحور Y مع استجابة I-Response في وحدات الاستشعار الحيوي ، ويتوافق المحور X مع النقاط الزمنية المختلفة وتركيزات التحليل في التجربة. تمثل الصورة الرسومية الموضحة هنا مخطط التل المناسب الذي تم إنشاؤه من برنامج التحليل الآلي. يتوافق المحور Y مع الاستجابة I-Response في وحدات الاستشعار الحيوي ، ويتوافق المحور X مع تركيزات التحليل المختلفة في التجربة.

تمثل الصورة الرسومية المعروضة هنا مخطط الارتباط الذي تم إنشاؤه باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. يتوافق المحور Y مع الاستجابة I في نهاية مرحلة الارتباط ، ويتوافق المحور X مع التركيزات المختلفة للتحليل Cdc37. في التجربة الثانية، تم استخدام مجموعة مختلفة من التركيزات التي تتراوح من 0.4 نانومولار إلى 200 نانومولار، وتظهر ملفات البيانات التي تم إنشاؤها هنا.

تمثل الصور الرسومية مخطط الحرارة ITC لتفاعل Hsp90 و Cdc37. تظهر هنا المنحنيات المتطورة للحرارة المقابلة التي تم الحصول عليها بسبب الحقن المتتالية ل Cdc37 في Hsp90 عند 298.15 كلفن. القوة التفاضلية المستخدمة هنا هي دالة للوقت.

تحدد نقاط البيانات المتكاملة في هذه المؤامرة الحرارة الطبيعية المقابلة مقابل نسبة مولر من Hsp90 إلى Cdc37. يتطلب نهج السحب المفتوح المستخدم هنا أن يكون لدى المستخدم إتقان أساسي للسحب اليدوي ، مع التأكد من عدم لمس المستشعر الحيوي بالحافة. تعتمد قابلية تكرار توقيت الخطوة بالكامل على المستخدم.

بمجرد أن يميز الباحث تفاعلا بين جزيئين حيويين ، يمكننا إجراء تجربة فحص من خلال تصميم مثبطات أو معدلات محتملة تستهدف التفاعل الجزيئي الحيوي المحدد باستخدام نظام FEB. يمكن استخدام هذا الإجراء لتحديد التفاعل المعروف والجديد بين البروتينات والتحقق منه وقياسه كميا ، وكذلك الجزيئات الصغيرة ، بما في ذلك الأدوية والببتيدات.