مقابلة : شحمي سكري تقديم المستضد بواسطة CD1d والعلاجية المحتملة لتنشيط الخلايا NKT

مرحباً، اسمي ميتشل كرونينبرج وأعمل في معهد لا جولا للحساسية والمناعة. أشغل حالياً منصب الرئيس والمدير العلمي، ولكن لدي مختبر أبحاث نشط للغاية، وهو ما سنتحدث عنه بالطبع، وهو إحدى التقنيات المتوفرة لدينا، وهي CD 1D tetramers. تتركز معظم الأعمال في مختبري حول الخلايا التائية المتفاعلة مع CD 1D.

وتتميز هذه الخلايا بكونها تتعرف على glycolipids بدلاً من peptides. كما يهتم فرع آخر من مختبري بموضوع مختلف تماماً، وهو الجهاز المناعي المخاطي وتنظيمه. وتعد جزيئات CD1 جزيئات مقدمة للمستضد (antigen presenting molecules)، وهذا يعني أنها ترتبط بالمستضدات أو شظايا البروتينات أو الجزيئات الأخرى وتعرضها ليتعرف عليها T-cell.

في الواقع، يوجد نوعان مختلفان من الجزيئات المقدمة للمستضد. هناك جزيئات تحمل أو تقدم الببتيدات، وهناك جزيئات تحمل الدهون والدهون السكرية. وتعمل جزيئات CD1 على حمل الدهون والدهون السكرية.

تلك هي وظيفتها، حيث تقوم هذه الجزيئات بربط أو تقديم هذه الليبيدات والليبيدات السكرية للخلايا التائية. وفي الواقع، هناك أربعة أنواع مختلفة من جزيئات CD1، وهي CD1A وCD1B وCD1C وCD1D. ونحن نركز هنا على CD1D، والذي يُعد على الأرجح الأكثر دراسة، ويرجع ذلك جزئياً إلى توفر نماذج فئران تجريبية. ويقوم CD1D بتقديم الليبيدات السكرية لنوع معين من الخلايا التائية يسمى الخلايا التائية القاتلة الطبيعية (natural killer T cell)، وهي خلية دم بيضاء غير تقليدية تمتلك خصائص من الاستجابتين المناعتين الفطرية والتكيفية.

يمكن أن تكون الجليكوليبيدات المعروضة جليكوليبيدات ذاتية، رغم أنها ليست مميزة جيداً في هذه المرحلة، أو يمكن أن تكون جليكوليبيدات ميكروبية. ومن المعروف أن الجليكوليبيدات المعروضة تأتي من مصدرين؛ أحدهما هو ما يسمى بكتيريا FMS، والتي ربما تكون البكتيريا الأكثر وفرة في الغلاف الحيوي.

تعيش هذه البكتيريا في المحيطات، وفي النباتات، وفي التربة. ومع ذلك، فهي لا تسبب المرض للكثير من الناس. وأفترض أننا اعتدنا كثيراً على التعايش مع هذه البكتيريا.

أما الفئة الثانية التي نعرفها، فهي نوع مختلف من الغليكوليبيدات تسمى الغليكوليبيدات المحتوية على dyl glycerol. وتوجد هذه في بكتيريا Borrelia borre، المسببة لمرض لايم، وربما في العديد من المسببات المرضية الأخرى. ونحن الآن بصدد الكشف عن الأنواع المختلفة من البكتيريا التي تمتلك هذه الغليكوليبيدات.

لذا، لدينا ما يسمى بالدهون السكرية الإشارية من SMS ودهون ثنائي الغليسيرول من Borrelia وربما العديد من الممرضات الحقيقية الأخرى. يتم تحميل هذه الدهون على جزيئات CD 1D الموجودة بشكل رئيسي على الخلايا التغصنية، رغم أنها قد تكون موجودة في الخلاmites البائية، وخلايا ER في الكبد، وربما أنواع أخرى من الخلايا. تمر جزيئات CD 1D هذه عبر الليزوزومات والاندوزومات حيث من المحتمل أن ترتبط بهذه الدهون، ثم تنقل هذه الدهون إلى سطح الخلية ليتم التعرف عليها بواسطة الخلايا التائية، بما في ذلك الخلايا التائية القاتلة الطبيعية التي ذكرتها سابقاً.

أحد الأشياء التي تحدث عند التعرض لبكتيريا تحتوي على glycolipids هو تنشيط خلايا NK T بسرعة كبيرة. أما خلايا T التقليدية، أو بعبارة أخرى، خلايا T المتفاعلة مع الببتيدات، فعادةً ما تستغرق ثلاثة أو أربعة أيام لإحداث استجابة مناعية جيدة، خاصة إذا لم تكن قد تعرضت للمستضد سابقاً.

بكلمات أخرى، إذا كانوا كذلك، فهم ساذجون. وفي المقابل، يمكن تنشيط خلايا NK T في غضون ساعات، حيث سيبدؤون في إنتاج السيتوكينات مثل gamma interferon، وهو أمر مهم للتخلص من البكتيريا في فترة زمنية قصيرة جداً. وبهذه الطريقة، فإنهم يشبهون جوانب من استجابة المناعة الفطرية وفقاً لهذا النموذج.

من خلال دراسة المستضدات النموذجية، نعلم أن CD 1D ينتقل إلى الأجسام النهائية المتأخرة والجسيمات الحالة، وهي مقصورات داخل خلوية حمضية للغاية حيث يتم تحميل المستضدات الغليكوليبيدية في CD one، وفي الواقع هناك بروتينات نقل خاصة داخل الخلايا المقدمة للمستضد، مثل الخلايا التغصنية، والتي تساعد في تحميل الليبيدات في جزيء CD 1D. وبالنسبة لبكتيريا fona وبكتيريا borre وغيرها، فإننا نتعامل مع بكتيريا خارج خلوية، لذا يجب نقل المستضدات الليبيدية بطريقة ما إلى داخل الخلية، ومن المرجح أن يتم ذلك عبر الجسيم الحالة لتحميلها في جزيء CD one.

وبعد ذلك يحدث تنشيط فوري لخلية NKT، ويجب أن يتم كل هذا في غضون بضع ساعات داخل الجيوب الوريدية، في الكبد، وفي الطحال، وربما في نخاع العظم ومواقع أخرى توجد فيها خلايا NKT. إن البنية الرباعية (tetrameric structure) هي المفتاح الأساسي لتحديد خلايا T القاتلة الطبيعية هذه بشكل لا لبس فيه، والتي تمتلك هذه الخصائص الفطرية التي تميزها عن خلايا T الأخرى. أما المؤشرات الأخرى المتاحة فهي غامضة للغاية، ولكن هذه الرباعيات (tetramers) تسمح لك بتحديد الخلايا بناءً على خصوصية مستقبل المستضد الخاص بها، وهو الأمر الجوهري الذي يحدد ماهيتها، وقد بدأ تصنيع الرباعيات منذ فترة طويلة.

اخترعه مارك ديفيس وجون ألمان، وكانت الفكرة تكمن في أن مستقبلات الخلايا التائية تتميز بألفة منخفضة، وإذا كنت ترغب في تحديد الخلايا أو التعرف عليها بناءً على نوعيتها، فإن الببتيدات التي تتعرف عليها أو معقدات الببتيدات وجزيئات تقديم المستضد لا تمتلك ألفة كافية، أو قوة ارتباط كافية تسمح لك بتحديد الخلية. وبناءً على ذلك، اخترع مارك ديفيس وجون ألمان تقنية الرباعيات (tetramer technology)، وهي وسيلة لصنع رباعيات، وفي بعض الحالات OCRs، من جزيء تقديم المستضد بالإضافة إلى الجزيء الذي يقدمونه، مما يزيد أساساً من ألفة التفاعل. وبذلك يمكنك رؤية الخلية النوعية لببتيد الإنفلونزا وجزيء تقديم مستضد معين، أو أي مستضد آخر تهتم بدراسته.

إنها تقنية بالغة الأهمية لأنها تتيح لك، على سبيل المثال، معرفة مدى فعالية نظام تطعيم معين. وما قمنا به منذ أواخر التسعينيات، حيث نشرت في الأصل ورقة بحثية في عام 2000 تم الاستشهاد بها حوالي 500 مرة حتى الآن، هو مجرد تطويع تلك التقنية لتُطبق على الدهون.

لذا قمنا بتصنيع جزيئات CD1 الذائبة، ومن خلال طرق سأصفها بعد قليل، تمكنا من تثبيتها، وبعبارة أخرى، ربطها بـ glycolipids محددة، وبهذه الطريقة استطعنا استخدامها ككواشف لفحص مستقبلات خلايا T محددة. أي تلك التي تتعرف على الـ Glycolipid الذي نهتم به بالإضافة إلى CD1d. يمكن استخدام هذه الـ Tetramers في أي حالة ترغب فيها في تحليل عدد خلايا NKT وحالة تنشيطها ووظيفتها.

وفي مختبرنا، يمكن أن يكون ذلك نابعاً من أي عدد من المشاريع المختلفة. فعلى سبيل المثال، إذا كنت ترغب في معرفة ما إذا كان طافر معين ومسار تأشير يؤثران على تطور خلايا NK T، فيمكننا القيام بذلك باستخدام التتRAMERS الخاصة بنا، والبحث في عدد خلايا NKT. كما توجد علامات أخرى، وبروتينات أخرى على سطح الخلية يمكننا فحصها لمساعدتنا في تقييم ما إذا كانت خلايا NKT ناضجة أو إذا كانت منشطة؛ وباستخدام التتRAMERS، وبعد التحفيز المستضدي، يمكننا أيضاً معرفة ما إذا كانت منشطة فحسب، وما هي السيتوكينات التي تنتجها.

لذا يمكننا الجمع بين صبغ التيترايمر (tetramer staining)، على سبيل المثال، مع صبغ السيتوكينات داخل الخلايا، والتساؤل عن النسبة المئوية لخلايا NKT التي تنتج gamma interferon، والنسبة المئوية التي تنتج IL four، والنسبة التي تنتج كليهما، وذلك باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد المعايير (multi parameter flow cytometry)؛ حيث يمكننا طرح مجموعة متنوعة من الأسئلة حول إنتاج السيتوكينات مباشرة من هذه الخلايا خارج الجسم (ex vivo). كما يمكننا أيضاً إجراء تجارب إضافية، فعلى سبيل المثال، يمكننا استخدام التيترايمرات لتنقية خلايا NKT لزراعتها في المختبر (in vitro) لدراسة كيفية تفاعلها مع أنواع أخرى من الخلايا، أو حتى لنقلها إلى حيوان مستقبل، قد يفتقر مثلاً إلى خلايا NKT لأسباب جينية.

نريد استعادة تلك الوظيفة. ويمكننا القيام بذلك والبحث في مواضع استقرار الخلايا وكيفية عملها. وأخيراً، أعلم أنه في حالة خلايا NKT البشرية، استخدم الباحثون بالفعل رباعيات القسيمات (tetramers) لتوسيع الخطوط الخلوية في المختبر (in vitro) لزيادة نمو الخلايا لأغراض تحليلية، وربما لأغراض علاجية أيضاً.

حسناً، نحن نستخدم نظام تعبير فيروس Bao لإنتاج رباعيات CD 1D. لذا تبدأ العملية بـ، بتركيبة DNA شائعة تحتوي على محفز وتعبير لـ BID two microglobulin والسلسلة الثقيلة لـ CD 1D. لذا، فإن جزيء CD one هذا هو عبارة عن دايمر غير متجانس يتكون من ببتيدين.

لدينا هذا النظام التعبيري الذي يحتوي على محفزين، ونقوم بإصابة خلايا الزراعة النسيجية الحشرية بفيروسات vao التي تم تحديد عيارها بدقة كما أوضح زميلي. ومن ثم نصيب الخلايا ونقوم باستخلاص البروتين الذي تعبر عنه الخلايا من وسط الزراعة النسيجية. وقد تم تصميم السلسلة الثقيلة لـ CD 1D خصيصاً لإنتاج الرباعيات (tetramers).

هناك أمران، أو بالأحرى ثلاثة أمور أقوم بها. الأول هو إزالة الجزء العابر للغشاء؛ وبذلك، نقوم بالتعبير عن بروتين ذائب.

ثانيًا، أضفنا وسم hexa-his لكي يمكن تنقية البروتين عن طريق كروماتوغرافيا أيونات المعادن. وثالثًا، لدينا ما يسمى بموقع beer لربط البيوتين الإنزيمي، وهذا هو الابتكار.

كان الأمر في غاية الأهمية عندما ابتكر ديفيس وألمان لأول مرة تقنية إنتاج التترايمر (tetramer). لذا، بعد استخلاص البروتين، يتم تنقيته باستخدام كروماتوغرافيا العمود بالنيكل هناك. وفي بعض الأحيان، نقوم بإجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم بعد ذلك.

وبعد ذلك، يمكن إجراء عملية البيوتينية الإنزيمية للبروتين ثم تحضينه، وبمجرد إتمام البيوتينية الإنزيمية، فإنه عند تحضينه مع strep ab، سيقوم بتكوين رباعيات (tetramers). أما بروتين CD one الذائب الذي تم تحضيره، فيمكن تحضينه أساساً طوال الليل في محلول من الجليكوليبيد المراد دراسته. ومن المهم جداً ألا يكون الجليكوليبيد مذاباً في DMSO، وهو المذيب أو المخفف المعتاد للجليكوليبيدات، لأن CD one حساس جداً تجاهه.

عادةً ما نستخدم محلولاً منظماً يحتوي على كمية صغيرة من tween و PBS. وهذا المحلول فعال جداً في إذابة معظم الجليكوليبيدات الخاصة بنا. ومن أجل التحميل في CD 1D، والذي يبدو أنه يحدث تلقائياً، نستخدم streptavidin من أي من مجموعة متنوعة من الشركات المصنعة.

وقد تم ربطها بـ pe أو fico أو eryn أو صبغات PC phycocyanin، ويبدو أن أيًا منها يعمل بشكل جيد للغاية ويمنحنا صبغة ممتازة. لذا، بشكل عام، فإن الإجراء لا يختلف كثيرًا عن الإجراءات الموصوفة بدقة لتحضير رباعيات MHC Class one، باستثناء أننا لا نستخدم التعبير البكتيري، بل نستخدم التعبير الفيروسي البكتيري، وبالطبع لدينا مستضدات دهنية بدلاً من الببتيدات. وهناك نقطة يجب أن أؤكد عليها وهي أن البشر لديهم خلايا NK T وتمتلك نفس النوعية الموجودة في خلايا NK T لدى الفئران.

لذا، فقد استمرت هذه الخصوصية لمدة 60 مليون سنة على الأقل منذ انفصالنا عن القوارض، وفي الواقع، نحن نصنع رباعيات CD 1D البشرية بنفس التقنيات التي يمكنك رؤيتها في الفيديو الذي تم إعداده هنا. ولكن في الحقيقة، تعمل خلايا NK T البشرية بشكل جيد جداً مع رباعيات الفأر والعكس صحيح. لذا، نحن لا نصنع الرباعيات البشرية بشكل متكرر لمجرد أنه يمكننا استخدام رباعيات الفأر في العمل على العينات البشرية.

لذا، هناك العديد من نماذج الفئران التي ثبت فيها أن خلايا NK T تُعد محددات حاسمة لنتائج الاستجابة المناعية. ويتراوح ذلك من الاستجابة للسرطانات وتنظيم أمراض المناعة الذاتية، وتطهير العوامل المعدية، وحتى تطور اللويحات التصلبية. وتعتبر هذه عملية التهابية مزمنة تحدث في الشرايين.

هناك بعض التساؤلات حول أهمية هذه الخلايا في البشر حيث تكون أقل وفرة، وقد وردت العديد من التقارير التي تشير إلى أنها تتغير في حالات المناعة الذاتية، كما توجد تقارير تفيد بأنها تكون وفيرة جداً في رئتي مرضى الربو. وعلى الرغم من وجود هذه التقارير، ومنها تقرير في المجلة الطبية البريطانية (England Journal of Medicine)، إلا أن هناك بعض الجدل حول ذلك. ولكن هناك عدد من الدراسات على البشر تشير إلى أن هذه الخلايا قد تكون مهمة.

فيما يتعلق بالتجارب السريرية، تم اختبار تحفيز خلايا NKT في أربع تجارب من المرحلة الأولى لمرضى السرطان في مراحل متقدمة. وهناك بعض الأدلة على الفعالية، وبالطبع، فإن هؤلاء المرضى يعانون من حالات مرضية شديدة، ولا تزال الدراسات مستمرة في عدة أنواع مختلفة من السرطانات. وهناك أشخاص مهتمون باستخدام العلاج بالخلايا NKT في الأمراض المناعية الذاتية أيضاً، على الرغم من أن هذا التوجه لم يبدأ تنفيذه فعلياً بعد.

قد تلعب الرباعيات (Tetramers) دوراً في هذه الدراسات بشكل أساسي من حيث تحليل ما حدث لخلايا NKT بعد العلاج بالمحفزات. لذا فإن الفكرة تكمن عادةً في استخدام محفزات الغليكوليبيد، أو في بعض الحالات حتى مضادات الغليكوليبيد التي تطورها مجموعات أخرى، وذلك اعتماداً على الاستجابة والحالة. ومن ثم يتم تقييم ما يحدث، أو ما حدث لخلايا NKT، وهو الأمر الذي يتم إجراؤه عادةً باستخدام الرباعيات.

أما الاستخدام المحتمل الآخر فسيكون في التوسع المخبري لخلايا NKT البشرية. من الممكن والعملي تماماً تنمية أعداد كبيرة من خلايا NKT البشرية في المختبر عن طريق التحفيز المستضدي، على سبيل المثال، وهو ما يمكن إجراؤه باستخدام التيترايمرات (tetramers) أو باستخدام خلايا تحتوي على الجليكوليبيدات المناسبة. وبالإضافة إلى استخدام التيترايمر أو الخلايا، يلزم إضافة السيتوكين.

ولكن في ظل هذه الظروف، يمكن زيادة أعداد كبيرة من خلايا NK T البشرية. وهناك أيضاً مجموعة واحدة على الأقل في بوسطن مهتمة بهذا النوع من العلاج بدلاً من العلاج القائم على الجليكوليبيد. كما يشارك جزء آخر من مختبري في دراسة المناعة المخاطية.

يركز معظم علماء المناعة على الخلايا اللمفاوية أو خلايا الدم البيضاء في العقد اللمفاوية والطحال. ومع ذلك، فمن المحتمل أن الغالبية العظمى منها موجودة في الواقع في المخاطية المعوية، وهو موقع يوجد فيه أيضاً ما بين 10¹⁴ إلى 10¹⁵ بكتيريا على الأرجح. لذا، فنحن معقمون إلى حد كبير من وجهة نظر ميكروبية، ولكن ليس في أمعائنا.

وكما يوجد في الأمعاء أيضاً مجموعة كبيرة جداً من خلايا الدم البيضاء. تمتلك هذه الخلايا خصائص فريدة، وهي في الواقع لم تخضع للدراسة بشكل كافٍ؛ لذا فإننا نجري بعض الاستقصاءات في العلوم الأساسية حول هذه الخلايا.

لكننا ندرس أيضاً عملية أسميها خلل التنظيم المناعي في الأمعاء، والتي تؤدي إلى مرض الأمعاء الالتهابي، وهي أساساً أمراض بوساطة مناعية تصيب إما الأمعاء الدقيقة أو الغليظة، وتعرف بمرض كرون أو التهاب القولون التقرحي. وعلى الرغم من قيامنا ببعض الأبحاث على البشر، إلا أن معظم عملنا يتم على نماذج الفئران. ولدينا ما أعتبره نماذج فئران جيدة جداً لخلل تنظيم الجهاز المناعي المخاطي الذي يؤدي إلى أعراض مشابهة لمرض كرون.

نحن ندرس هذه العملية وسبل التدخل فيها أيضاً، وذلك على أمل تطوير علاجات أفضل للمرضى الذين يعانون من هذه الأمراض المناعية. وفي الختام، قد نفكر قليلاً في التوجه الذي سيسلكه علم المناعة خلال السنوات العشر القادمة أو نحو ذلك، وهو أمر من الصعب حقاً التنبؤ به، مهما بدا ذلك مفاجئاً.

أعتقد أن الجهاز المناعي المخاطي هو أحد المجالات الرئيسية غير المستكشفة في علم المناعة في الواقع. على الرغم من أن المزيد والمزيد من الأشخاص والمجموعات البحثية البارزة بدأت تهتم بدراسات المناعة المخاطية. وأعتقد أن هناك مجالاً آخر سيكون له تأثيرات هائلة وهو علم الوراثة، وخاصة الوراثة البشرية، فبينما ننتقل أو نتقدم، كما يجب أن أقول، نحو تسلسل 1,000 جينوم بشري، سيكون من الممكن حقاً إجراء دراسات على الأفراد وتقييم كيفية تأثير تباين DNA على الاستجابة المناعية.

في الوقت الحالي، تعتمد معظم أفضل الأبحاث حول المسارات الأساسية على القوارض. وتعد القوارض، ولا سيما الفئران، بالغة الأهمية لدراساتنا. ولكنني أعتقد أننا في المستقبل، عندما ندرس الظواهر المناعية الذاتية المعقدة أو الأمور الأخرى التي قد تحدث لدى الأفراد، سنتمكن من القيام بذلك بناءً على تعدد الأشكال الجينية البشرية.

سنتمكن من تقييم تعدد الأشكال الجينية، ومن ثم استخدام تلك المعلومات لمحاولة التنبؤ بكيفية تأثير ذلك على الاستجابات المناعية، والتوجه في نهاية المطاف نحو ما أسميه، وما يسميه الآخرون، العلاجات المناعية الشخصية، أو بمعناه الأوسع، الطب الشخصي. لذا، سيكون لعلم الوراثة تأثير هائل؛ فنحن نمتلك بالفعل أدوات رائعة في علم الوراثة الخاص بالفئران.

بإمكاننا تعطيل أي جين نريده. كما يمكننا تعطيل تعبير الجينات في أنواع خلوية محددة. إننا قادرون على تحقيق إنجازات مذهلة.

ولكنني أعتقد أننا في المستقبل سنسعى لفهم الاستجابة المناعية والمناعة من منظور الاستجابات البشرية.