الطرق الكهروفسيولوجية لقياس مستويات التصبغ الضوئي في مستقبلات ذبابة الفاكهة الضوئية

هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للفحص الجيني لمسوخ ذبابة الفاكهة المعيبة بصريا. وذلك لأنها تسمح بالكشف عن التشوهات الصغيرة في النقل الضوئي لذبابة الفاكهة ، خاصة في مستويات الصباغ الضوئي والوظائف المتعلقة بالأقران في الطبقة. هذه التقنية عميقة في الجسم الحي ، فهي سهلة التنفيذ وقوية للغاية ، مما يتيح اكتشاف التغيرات الصغيرة في نشاط بروتينات النقل الضوئي.

في رأيي ، ربما يكون إصلاح الذباب مع الحفاظ على قابلية البقاء هو الجزء الحاسم من هذه الطريقة. قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج Clampex. قم بتشغيل مكبر الصوت ومولد النبض Master-8 ، ثم قم بتشغيل مصباح الزينون ووحدة التحكم في الغالق.

قم بتشغيل المجتذب ووضع الشعيرات الدموية الزجاجية في المجتذب واسحبها. قم بإزالة الشعيرات الدموية الزجاجية من المسحوب. املأ الشعيرات الدموية الزجاجية بمحلول رنين مصفى باستخدام حقنة طرف ممدودة.

أدخل القطب الكهربائي السلكي في الشعيرات الدموية الزجاجية. تأكد من أن المحلول داخل الشعيرات الدموية على اتصال بالسلك الفضي. أدخل حاملات الأقطاب الكهربائية في اثنين من المتلاعبين الدقيقين بالقطب الكهربائي.

قم بتشغيل مصدر الطاقة لمكواة اللحام. اضبط التيار على 2.25 أمبير تقريبا. يجب أن يسخن هذا التيار خيوط البلاتين والإيريديوم 0.25 ملم إلى حوالي 55 إلى 56 درجة مئوية.

ضع قطرة من الشمع مع درجة حرارة انصهار منخفضة على مكواة اللحام. تخدير الذباب داخل الزجاجة. صب الذباب المخدر في حاوية النوم ، واختر ذبابة واحدة وقم بتغطية بقية الذباب بطبق بتري.

امسك الذبابة بعناية من جناحيها باستخدام ملاقط حادة وضعها على حامل الذبابة. على حامل الذبابة ، ضع الذبابة ملقاة على جانبها مع ظهرها نحو اليد. باستخدام ملاقط ، ارفع الذبابة من أجنحتها وثبت أجنحتها على حامل الذبابة باستخدام مكواة اللحام.

قم بتوصيل ظهر الذبابة بسطح الحامل بالشمع باستخدام مكواة اللحام. اخفض طرف مكواة اللحام إلى نقطة الالتصاق بالساقين ، ثم قم بإذابة الشمع لتغطية جميع الساقين معا. ضع قطرة صغيرة من الشمع بين الرأس والرقبة في منطقة الرقبة.

ضع حامل الذبابة في قفص فاراداي مظلم على كتلة مغناطيسية وتأكد من أن الذبابة تبعد حوالي خمسة ملليمترات عن نهاية دليل الضوء. ضع قطب التسجيل فوق عين الذبابة والقطب الأرضي فوق الجزء العلوي الخلفي من الذبابة باستخدام المتلاعبين الدقيقين. ثم أدخل القطب الأرضي في الجزء الخلفي من الذبابة باستخدام المتلاعبين الدقيقين.

أدخل قطب التسجيل في المحيط الخارجي لعين الذبابة ، ويفضل استخدام المتلاعبين الصغار. أغلق قفص فاراداي وأطفئ الأنوار في الغرفة للسماح بالتكيف مع الظلام لمدة خمس دقائق. أدخل المعلمات التي تبدأ من مدة نبضة تبلغ 500 متر في الثانية ، وفاصل نبضي يبلغ 60 ثانية ، وعدد النبضات مضبوطة على ستة.

لقياس المساعد الشخصي الرقمي ، اضبط مولد النبض Master-8 في وضع TRAIN ، ثم قم بإعطاء نبضة ضوئية مدتها خمس ثوان ذات كثافة قصوى باستخدام مرشح برتقالي. تحقق من استجابة الجهد. استبدل الفلتر البرتقالي بمرشح أزرق عريض النطاق وامنح ثلاث نبضات ضوئية مدتها 5 ثوان بأقصى كثافة.

تحقق من استجابة الجهد. انتظر 60 ثانية على الأقل في الظلام. استبدل الفلتر الأزرق بالفلتر البرتقالي السابق.

ثم أعط نبضتين ضوئيتين مدتهما 5 ثوان مع فترات زمنية مدتها 60 ثانية. تحقق من استجابة الجهد. لقياس جهد ERP M ، قم بإعطاء نبضة ضوء أزرق مستمرة حتى يتم الوصول إلى استجابة جهد الحالة الثابتة.

أعط وميضا ضوئيا مكثفا قصيرا بطول موجي يتراوح بين 350 إلى 700 نانومتر باستخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 20 نانومتر. ثم قم بقياس سعة الذروة لمرحلة M1 من الاستجابة المحتملة M ، والتي تعكس امتصاص metarhodopsin عند هذا الطول الموجي المحدد عند التوازن الضوئي. تم تقييم استجابات PDA للذباب المتحور المختلف.

أظهر الذباب من النوع البري إزالة استقطاب مشبعة في الظلام ظهرت على شكل ERG سلبي طويل الأمد للقرنية ، بعد تحفيز مكثف للضوء الأزرق. أنتجت الأضواء الزرقاء التالية استجابات صغيرة متراكبة على المساعد الشخصي الرقمي ، تفتقر إلى العابرين والإيقاف. في الذباب المتحور ذو التكوين الحيوي غير الطبيعي للصبغة الضوئية مثل ninaE ، عادت استجابة الجهد إلى خط الأساس بعد تحفيز الضوء الأزرق المكثف ، ولم يتم قمع الاستجابة لضوء أزرق إضافي وأظهرت طبيعية داخل وخارج العابرين.

يتم الحصول على ERP من النوع البري للذبابة بنفس البروتوكول ، ولكن يتم تطبيق وميض أخضر مكثف أثناء PDA. هذا الوميض الأخضر يثير ERP وقمع PDA. تم الحصول على إمكانات M بواسطة الوميض الأخضر بعد الإضاءة الزرقاء ، ولكن ليس عن طريق الوميض الأزرق بعد الإضاءة الزرقاء في الذبابة البرية.

تم تكرار هذا البروتوكول في النوع البري ، في المتحور hypomorph hypomorph ninaE ، وفي المتحور الذي يعاني من نقص في النقل الضوئي مع مستويات التصبغ الضوئي الطبيعية norpA. تم حساب أطياف الامتصاص النسبية لرودوبسين الذبابة والميتارودوبسين من القياسات الضوئية لمختلف الطيف وطيف التوازن الضوئي. من المهم لبقاء الذباب الانتباه إلى لزوجة الشمع عن طريق الامتناع عن ارتفاع درجة الحرارة.

هذا الإجراء مناسب للطفرات الجينية وعن طريق فحص الطفرات البصرية المعيبة. قد تسهل الطرق التي تعزل الطفرات البصرية وتحددها بشكل عشوائي اكتشاف بروتينات وآليات جديدة تشارك في النقل الضوئي لذبابة الفاكهة. مكن بروتوكول PDA من عزل الآليات البصرية المهمة والجديدة.

ربما لم تكن المشاركة لتكتشف أو حتى تتوقع خلاف ذلك.