مقايسة قائمة على التألق لإمكانات الغشاء لدراسة وظيفية عالية الإنتاجية لقناتين أيونيتين داخليتين في خطين خلويين ظهاريين

توفر مقايسات إمكانات الغشاء القائمة على التألق طرقا قوية لدراسة تأثيرات المعدلات على القنوات الأيونية التي يتم التعبير عنها داخليا في الخلايا الظهارية. كدليل على المفهوم ، نحن نقيس وظيفة قناتين أيونيتين في خطوط الخلايا الطلائية المعروفة. هذا الفحص متعدد الاستخدامات ، لأنه يستخدم مسبارا كيميائيا خارجيا لقياس وظيفة القناة الأيونية ، وبالتالي تجاوز الحاجة إلى مجسات مشفرة وراثيا.

يمكن لهذه المقايسات عالية الإنتاجية تحديد وتوصيف آثار معدلات الجزيئات الصغيرة على القنوات الأيونية ، والتي لديها القدرة على تطوير علاجات التليف الكيسي. للبدء ، قم بزراعة خلايا Calu-3 و Caco-2 في قارورة T75 تحتوي على EMEM مع 20٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. نضح الوسط من قارورة T75 بعد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80 إلى 100٪.

اغسل الخلايا برفق ب 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. ثم أضف 2 ملليلتر من التربسين المسخن مسبقا 0.25٪ ، مع 0.1٪ EDTA ، إلى الطبقة الأحادية للخلية. ضع القارورة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا.

في هذه الخطوة ، تأكد من رفع الخلايا من سطح الدورق وتفككها إلى تعليق الخلية الواحدة. أضف 8 ملليلتر من وسط الثقافة لتحييد التفاعل. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 30 إلى 40٪ ، أضف 1.5 ملليلتر من تعليق الخلية إلى 18.5 ملليلتر من وسط الثقافة في أنبوب مخروطي واخلطها.

أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية هذا إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا للحصول على ما يقرب من 140،000 خلية لكل بئر. للوحة واحدة كاملة من 384 بئرا ، أضف 1 ملليلتر من معلق الخلية إلى 17 ملليلتر من وسط الاستزراع في أنبوب مخروطي للحصول على ما يقرب من 50،000 خلية لكل بئر. بعد الخلط ، أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى كل بئر.

قم بتغيير الوسط كل يومين وتأكد من وصول الخلايا إلى التقاء 100٪ في غضون ثلاثة إلى خمسة أيام في جميع الآبار في وقت واحد. تغيير الوسيط قبل 24 ساعة من الدراسات الوظيفية. أولا ، قم بإعداد محلول المخزن المؤقت الخالي من الصوديوم والكلوريد باستخدام الكواشف المدرجة في بروتوكول النص.

أضف الكواشف إلى درجة زراعة الأنسجة ، الماء المقطر المزدوج. اترك الكواشف تذوب عن طريق التقليب طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد استقرار المحلول ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 عن طريق إضافة 1 مول من محلول NMDG بالتنقيط.

تخلط لمدة 30 دقيقة وضبط الأسمولية من الحل إلى نطاق من 300 زائد أو ناقص 5 ملليمول لكل كيلوغرام. قم بتصفية وتخزين المحلول العازل في زجاجات معقمة. بعد ذلك ، قم بإذابة 0.5 ملليغرام من صبغة الغشاء المحتملة في 1 ملليلتر من المخزن المؤقت الخالي من الصوديوم والكلوريد وقم بتسخين المحلول إلى 37 درجة مئوية.

قم بإزالة وسط الاستزراع من أحاديات طبقة الخلايا Calu-3 و Caco-2. أضف 195 ميكرولترا من محلول الصبغة لكل بئر للوحة 96 بئرا ، و 95 ميكرولترا لكل بئر للوحة 384 بئرا. اترك الخلايا تحمل الصبغة لمدة 35 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد ذلك ، خذ قياسات مضان مع الإثارة عند 530 نانومتر والانبعاثات عند 560 نانومتر. في البداية ، خذ قراءات أساسية مستمرة لمدة خمس دقائق على فترات 30 ثانية. ثم أضف 5 ميكرولتر من محلول فورسكولين 400 ميكرومولار إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا ، للحصول على تركيز فورسكولين النهائي لميكرومولار واحد.

بالنسبة للوحة 384 بئرا ، أضف خمسة ميكرولتر من محلول فورسكولين 20 ميكرومولار. خذ معدل التحفيز لمدة 20 دقيقة مع القياسات على فترات 15 ثانية. بعد ذلك ، أضف 5 ميكرولتر من محلول 400 ميكرومولار من مثبط CFTR إلى لوحة 96 بئرا ، للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ميكرومولار.

إلى لوحة 384 بئر ، أضف 5 ميكرولتر من مثبط CFTR 200 ميكرومولار. خذ قراءة تثبيط لمدة 15 دقيقة مع القياسات على فترات 30 ثانية. تحديد قياسات شدة التألق لكل بئر وتصدير القيم كجدول بيانات.

في شكل عمود ، يحتوي على آبار فردية. لحساب التغيرات التي يسببها فورسكولين ، قسم قياسات وحدة التألق النسبية من كل بئر من لوحة 96 بئرا على آخر قياس لشدة التألق لقراءة خط الأساس ، ورسمها. قم بقياس استجابات الذروة كأقصى شدة مضان تم قياسها من خط الأساس أثناء تحفيز فورسكولين.

استخدم هذا القياس ، أو المنطقة الواقعة أسفل المنحنى ، لتحديد استجابة CFTR. تم الكشف عن وظيفة CFTR على أنها إزالة استقطاب الغشاء بعد تحفيز فورسكولين في خلايا Caco-2. تم الكشف عن تدفق الفلورايد كزيادة حادة في التألق مقارنة ب DMSO كعنصر تحكم في السيارة.

بعد تحفيز فورسكولين ، تم الحفاظ على إشارة الفلورسنت حتى إضافة مثبط CFTR ، وبعد ذلك كان هناك انخفاض سريع في شدة التألق. كانت هذه الظاهرة قابلة للتكرار في كل من خلايا Caco-2 و Calu-3. تم حساب نشاط CFTR على أنه الفرق في التغيير الأقصى في التألق بعد تحفيز فورسكولين أو DMSO.

تراوحت النقاط الفردية بين زائد أو ناقص 3 انحرافات معيارية عن المتوسط في حالة تحفيز فورسكولين والتحكم في DMSO ، مما يشير إلى قابلية استنساخ الفحص. لتأكيد خصوصية الاستجابات الوظيفية ، يمكن التحقق من صحة فحوصات إمكانات الغشاء هذه باستخدام الطرق الكهربية التقليدية ، مثل غرفة الاستخدام. هذه المنصة قادرة على سد الفجوة بين شاشات المغير عالية الإنتاجية وأنظمة التعبير غير المتجانسة والقياسات الكهربائية الحيوية التي تستغرق وقتا طويلا في الأنسجة الأولية التي يصعب الوصول إليها.