نهج فحص المذنب عالي الإنتاجية لتقييم تلف الحمض النووي الخلوي

يستخدم فحص المذنب على نطاق واسع لتقييم السمية الجينية. يقدم بروتوكولنا عددا من المزايا المنهجية مقارنة بفحص المذنب القياسي. تركز تقنيتنا على تثبيت شرائح المذنب القياسية عموديا ومعالجتها على دفعات من 25 في رف مصنوع لهذا الغرض.

وهذا يشمل الرحلان الكهربائي ، وبالتالي فإن الخزان أصغر ، ويستخدم مساحة تخزين مؤقت أقل ، ولديه تبريد متكامل. عند حملها في رف ، تكون المواد الهلامية الحساسة على الشرائح أكثر حماية وتنتقل من محلول إلى آخر في 25 ثانية. باستخدام بروتوكول مذنبات الدم لدينا ، يمكن للباحثين استخدام وخز دبوس من الدم لدراسة تلف الحمض النووي في البشر ، والأنواع الأخرى ، ومجموعة واسعة من التعرض البيئي السمية الجينية المحتملة.

أي من التنسيقات المختلفة لفحص المذنب التي تستخدم شرائح المجهر كدعم قوي لهلام المذنب قابلة لنهجنا. الجزء الحاسم من هذه التقنية هو تحميل العينات بعد الخلط مع الأغاروز LMP. يجب تحميل العينات بسرعة دون صنع فقاعات وتغطيتها بغطاء على الفور قبل التصلب.

للبدء ، قم بإعداد 0.6٪ من الأغاروز منخفض درجة الانصهار في PBS وضعه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. قم بتسمية الطرف المتجمد للشرائح المطلية مسبقا بمعلومات الاسم والتاريخ والعلاج باستخدام علامة دائمة أو قلم رصاص. ضع صفيحة تبريد على مقعد مسطح وأدخل حزمتي تبريد مجمدتين في الدرج المنزلق أسفل السطح المعدني.

ثم ضع الشرائح على الطبق المبرد لتبرد مسبقا لمدة دقيقة إلى دقيقتين. جهاز طرد مركزي وإزالة supernatant من أنابيب العينة ووضعها على الفور مرة أخرى على الجليد. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 200 ميكرولتر من الأغاروز منخفض الانصهار بنسبة 0.6٪ واخلطها عن طريق السحب.

بعد ذلك ، أضف 80 ميكرولتر من الخلايا المحتوية على الأغاروز على شريحة مبردة وضع زلة غطاء بسرعة على الجل. اترك الجل يوضع على طبق التبريد لمدة دقيقة إلى دقيقتين. في غضون ذلك ، قم بإعداد 500 ملليلتر من محلول العمل من المخزن المؤقت للتحلل وصبه في طبق التحلل.

بعد ضبط المواد الهلامية، قم بإزالة انزلاقات الغطاء بسرعة عن طريق إمساك الشريحة برفق بين الإبهام والسبابة وانزلاق الغطاء عن الجل. ثم ضع الشرائح داخل حامل الشرائح مع كل علامات النقاط السوداء على الشرائح التي تواجه في نفس الاتجاه. ضع حامل الشريحة داخل طبق التحلل.

أغلق غطاء طبق التحلل وضعه للحضانة. قم بإزالة حامل الشريحة بعناية من طبق التحلل دون إزعاج المواد الهلامية. ضع حامل الشريحة برفق في طبق غسيل محمل مسبقا بالماء المقطر المزدوج البارد المثلج.

تأكد من غمر الشرائح بالكامل واترك الإعداد لمدة 30 دقيقة. ضع حزمة تبريد مجمدة تحت خزان الرحلان الكهربائي للحفاظ على درجة حرارة التخزين المؤقت المثلى. ثم ، أضف محلول عمل الرحلان الكهربائي البارد إلى الخزان وانقل حامل الشريحة إليه.

قم بتوجيه الشرائح بحيث تشير المواد الهلامية المحتوية على الخلايا نحو الكاثود. احتضن الشرائح في خزان الرحلان الكهربائي لمدة 20 دقيقة للسماح للحمض النووي بالاسترخاء. ثم قم بتشغيل مصدر الطاقة لإجراء الرحلان الكهربائي لمدة 20 دقيقة بسرعة 1.19 فولت لكل سنتيمتر.

بعد اكتمال الرحلان الكهربائي ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وإزالة حامل الشريحة من خزان الرحلان الكهربائي. اسمح لحامل الشريحة بالتصريف على المناديل الورقية لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، ضع حامل الشريحة في طبق يحتوي على مخزن مؤقت للتحييد واتركه لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، ضعه في طبق غسيل يحتوي على ماء مقطر مزدوج بارد مثلج واتركه لمدة 20 دقيقة. بعد الغسيل ، قم بإزالة حامل الشريحة من الماء واترك الشرائح تجف في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لإعادة ترطيب الشرائح، انقل حامل الشرائح إلى طبق غسيل يحتوي على ماء مقطر مزدوج بارد مثلج واتركه لمدة 30 دقيقة.

ثم ، ضع حامل الشريحة في طبق تلطيخ يحتوي على 2.5 ميكروغرام لكل محلول يوديد بروبيديوم ملليلتر. أغلق غطاء طبق التلطيخ واحتضنه لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، انقل حامل الشريحة إلى طبق منفصل واغسله بالماء المقطر المزدوج البارد لمدة 20 دقيقة.

قم بإزالة حامل الشريحة من الطبق وجففه تماما في الظلام ، إما في حاضنة 37 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة. بعد أن تجف الشرائح تماما، قم بتخزينها في صندوق شرائح في الظلام حتى تصبح جاهزة لتحليل الصور. تم تشعيع الخلايا الكيراتينية البشرية بجرعات مختلفة من UVA و UVB أو معالجتها ببيروكسيد الهيدروجين 50-micromolar للحث على تلف الحمض النووي.

كان الجهد الأمثل 1.19 فولت سنتيمتر ، لأنه يحفز الاستجابة الأكثر حساسية وأكبر نسبة من الحمض النووي للذيل. تم تشعيع الدم البشري الكامل بجرعات مختلفة من UVA ومعالجته بتركيزات مختلفة من Fpg. كشف فحص المذنب القلوي عالي الإنتاجية أن المستويات المثلى لتلف الحمض النووي تم تحفيزها بأربع وحدات لكل ملليلتر من Fpg.

تم علاج خط خلايا سرطان المبيض SK-OV-3 بمزيج من سيسبلاتين وبيروكسيد الهيدروجين. لم تظهر الخلايا غير المكشوفة أي ضرر. أدى التعرض لبيروكسيد الهيدروجين وحده إلى توليد متوسط كبير للحظة ذيل الزيتون مقارنة بالخلايا التي تم فيها تحفيز الروابط المتقاطعة داخل الحمض النووي.

بعد العلاج ب 100-micromolar cisplatin ، زادت الروابط المتقاطعة داخل الحمض النووي مع ذروة في 12 ساعة ، وبعد ذلك انخفضت المستويات إلى الصفر بعد 30 ساعة من الضروري وضع كيس الثلج في خزان الرحلان الكهربائي واحتضان الشرائح لمدة 20 دقيقة لاسترخاء الحمض النووي قبل الرحلان الكهربائي. ستساعد هذه الخطوة الحمض النووي التالف على السفر عن طريق التيار. سمح لنا تشغيل الفحص باستخدام شرائح موضوعة عموديا بأتمتة فحص المذنب.

بالإضافة إلى ذلك ، قامت تقنيتنا بتبسيط فحص المذنب للبحث.