تقييم أكسدة الركيزة الطاقة في المختبر مع ¹⁴CO₂ Trapping

استخدام ركائز الطاقة المختلفة هو نوع الخلية المحدد ومؤشر المرض. يمكن أن يلقي قياس استهلاك الركائز المحددة الضوء على كل من البيولوجيا الطبيعية وعلم الأمراض. لا تحتاج هذه التقنية إلى معدات متخصصة ويسهل توسيع نطاقها.

كما أنه أسهل في الاستخدام من الطرق المنشورة السابقة. سيسمح فهم التغيرات في معدل أكسدة الركيزة بتطوير التدخلات الغذائية والدوائية للاضطرابات الأيضية. على الرغم من أنها مثبتة مع أنسجة العظام ، إلا أنها مخصصة بسهولة لدراسة المرونة الأيضية في جميع أنواع الخلايا مما يوفر فهما لكل من أسباب وعواقب التحولات الأيضية.

بعد التضحية بالجراء من ثلاثة إلى خمسة أيام بعد الولادة ، قم بنقلها إلى الجليد البارد D PBS الذي يحتوي على محلول مضاد حيوي مزدوج من البنسلين ستربتومايسين. تعريض الكالفاريا عن طريق إزالة الجلد والأنسجة الرخوة. اجمع المنطقة الوسطى عن طريق قطع الأنسجة المحيطة من الخلف إلى الأمام في D PBS.

خدش الأسطح الداخلية والخارجية للكالفاريا بلطف باستخدام ملاقط للمساعدة في إطلاق الخلايا عند الهضم اللاحق. تحضير 2 و 4 ملليغرام لكل ملليلتر محاليل من الكولاجيناز من النوع الثاني في D PBS وتصفية كل حل مع مرشح جديد 0.22 ميكرومتر. أولا ، هضم الكالفاريا التي تم تنظيفها بملليغرام لكل محلول كولاجيناز ملليلتر لمدة 15 دقيقة ، ثم تخلص من محلول الهضم.

بعد ذلك ، هضم العينات النظيفة في أربعة ملليغرام لكل محلول كولاجيناز ملليلتر ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة في كل مرة. ثم ، اسحب محلول الهضم واحفظه. قم بتصفية محلول الهضم من خلال مصافي خلايا 70 ميكرومتر وقم بالطرد المركزي للترشيح عند 300 RCF لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق بيليه الخلية في وسط MEM alpha الكامل الذي يحتوي على 10٪ FBS ومحلول مضاد حيوي مزدوج من الستربتومايسين البنسلين. عد الخلايا وزرعها في صفيحة 10 سم. استزرع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام.

ثم ، قم بفصل الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 0.25 Trypsin EDTA. بعد الهضم ، عد الخلايا وزرعها في صفيحة زراعة خلايا 24 بئرا مع وسط ألفا MEM كامل يحتوي على 10٪ FBS ومحلول مضاد حيوي مزدوج للبنسلين ستربتومايسين. زرع ما لا يقل عن أربعة آبار لكل نوع خلية لكل ركيزة ، وثلاثة آبار إضافية على الأقل لكل نوع خلية للعد قبل الفحص.

استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد إزالة العضلات والنسيج الضام من الفئران البالغة من العمر ثمانية أسابيع وجمع عظم الفخذ والتيبياس ، قم بقطع والتخلص من طرفي العظام بمقص حاد. اطرد نخاع العظم من عظم الفخذ والساق في طبق بتري طازج بطول 10 سنتيمترات باستخدام حقنة مزودة بإبرة قياس 23 تحتوي على 15 ملليلتر من وسط MEM alpha الكامل مع محلول مضاد حيوي مزدوج من FBS البنسلين الستربتومايسين بنسبة 10٪ ، و 10٪ CGM 14 12 وسط مشروط.

استزرع الخلايا في طبق بتري في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد ثلاثة أيام ، تخلص من وسائط الثقافة واشطف الخلايا باستخدام D PBS. فصل الخلايا المرفقة عند 37 درجة مئوية مع 0.25٪ التربسين EDTA لمدة خمس دقائق.

بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق بيليه الخلية في وسط BMM. عد الخلايا وزرعها في صفيحة زراعة خلايا البئر 24 وفقا للإجراء الموصوف سابقا. استزرع عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في وسط BMM قبل البدء في الفحوصات.

اغسل الخلايا في الآبار الإضافية مرتين باستخدام D PBS. فصل الخلايا مع 0.25٪ التربسين EDTA. أعد تعليق 20 ميكرولتر من الخلايا المهضومة في D PBS.

مع 20 ميكرولتر من محلول صبغة الأكريدين البرتقالي والبروبيديوم يوديد ، حدد عدد الخلايا الحية باستخدام عداد خلية آلي وسجل العدد. اغسل الخلايا في آبار الفحص مرتين باستخدام D PBS. أضف 500 ميكرولتر من الوسط الساخن إلى كل فحص جيدا في غطاء زراعة الأنسجة المخصص لذاكرة الوصول العشوائي.

بعد إغلاق اللوحة باستخدام البارافيلم ، احتضن الخلايا في حاضنة RAM مخصصة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. أثناء الحضانة ، قم بتقطيع ورق الترشيح إلى قطع دائرية ، أكبر قليلا من المساحة داخل غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 ملليلتر وأدخل الورق بشكل مريح في الغطاء. أضف 200 ميكرولتر من حمض بيركلوريك واحد 1 مولي إلى كل أنبوب و 20 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم إلى ورقة الترشيح المثبتة داخل الغطاء.

بعد احتضان الخلايا ، انقل 400 ميكرولتر من وسط الثقافة من كل بئر إلى الأنابيب المحضرة وأغلق الأغطية على الفور. اترك الأنابيب في رف أنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قام Parallelae أثناء الحضانة بإعداد قارورة تلألؤ لكل أنبوب وملئها بأربعة ملليلترات من سائل اللمعان.

انقل كل قطعة من ورق الترشيح إلى قارورة تلألؤ واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. قم بإجراء اختبارات المسح على غطاء محرك السيارة والحمام المائي والثلاجة والحاضنة والحوض والأرض وأي منطقة عمل أخرى بحثا عن تلوث محتمل بذاكرة الوصول العشوائي. ضع مناديل الورق في قوارير تلألؤ تحتوي على سائل لمعان.

قم بقياس النشاط الراديوي للكربون 14 في قوارير التلألؤ باستخدام عداد تلألؤ وسجل نتائج القراءة. تطهير بيئة العمل، وفقا لإرشادات السلامة من الإشعاع، إذا لزم الأمر. يقارن الشكل أكسدة الركيزة بواسطة الخلايا العظمية الأولية قبل الكالفاريا مقابل BMMs.

بعد مرور الخلايا الأولية وزراعتها في وسط MEM alpha الكامل بين عشية وضحاها ، فإنها عادة ما تصل إلى 80 إلى 90٪ من الالتقاء وتظهر مورفولوجيتها المميزة. الأرومات العظمية الكلفاري قبل العظم أكبر بشكل ملحوظ من BMMs. أظهرت نتائج أكسدة الركيزة أن معدل الأكسدة لكل ركيزة أعلى بكثير في الخلايا العظمية قبل الجلجثة من BMMs ، مما يشير على الأرجح إلى ارتفاع إنتاج الطاقة عن طريق الفسفرة التأكسدية في الخلايا العظمية قبل العظام.

يجب أن تكون الورقة الثالثة المدرجة أكبر قليلا من غطاء أنبوب علوي 1.7 ملليلتر إيبين. يمكن استخدام هذه الطريقة بالتزامن مع استهلاك الأكسجين وتحديد المعدل العام للفسفرة التأكسدية والإنتاج اللبني في الخلايا. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد استخدام الركيزة خلال مراحل التمايز المتميزة أو إعدادات المرض.

مع هذه المعرفة يمكننا تطوير التدخلات لاضطرابات التمثيل الغذائي.