تقييم وظيفة الميتوكوندريا في العصب الوركي عن طريق قياس التنفس عالي الدقة
مايو 5, 2022
يحدد قياس التنفس عالي الدقة إلى جانب مستشعرات التألق استهلاك أكسجين الميتوكوندريا وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يصف هذا البروتوكول تقنية لتقييم معدلات التنفس الميتوكوندريا وإنتاج ROS في العصب الوركي المتغلغل.
يسمح هذا البروتوكول بتقييم وظيفة الميتوكوندريا داخل العصب عن طريق تقسيم الميتوكوندريا المعزولة ، وهو إجراء صعب في نسيج صغير يحتوي على عدد محدود من الميتوكوندريا. توفر هذه التقنية إمكانية تحليل وظائف الميتوكوندريا مثل استهلاك الأكسجين وإنتاج ROS في وقت واحد في الميتوكوندريا المحفوظة في الموقع. مع العديد من الركائز والمثبطات وبروتوكولات تصميم غير المقترنة.
تشترك العديد من الأمراض في وظيفة الميتوكوندريا ، ولا سيما الاعتلالات العصبية الناجمة عن مرض السكري من النوع الثاني أو العلاج الكيميائي. في هذه الأمراض ، تعد ضعف الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا هي العلامة الوحيدة التي تملي تطور المرض. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في علم الأحياء العصبية والكيمياء الحيوية وعلم الأدوية ، مع التحقيق في آليات مرض الميتوكوندريا ، والبحث عن العلاجات ، مثل معززات الميتوكوندريا أو آلام الأعصاب المخففة.
للبدء ، قم بمعايرة مستشعرات الأكسجين عن طريق سحب 2.1 ملليلتر من المخزن المؤقت MR في كل غرفة. أغلقه بالسدادات واسحب الهواء إلى الغرفة حتى يتم تشكيل فقاعة. يحرك المزيج على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في وضع المعايرة حتى يستقر تدفق الأكسجين لكل كتلة.
باستخدام برنامج HRR ، قم بإجراء معايرة الهواء لمستشعرات الأكسجين المستقطبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لإعداد الأنسجة ، ضع العصب الوركي في طبق بتري مع ما يكفي من TP العازلة لتغطيته. امسك أحد طرفي العصب باستخدام ملقط ومع زوج آخر من الملقط اسحب الحزم العصبية أفقيا.
أولا ، انقل الأنسجة المعروضة إلى طبق صغير يحتوي على مخزن مؤقت TP ملليلتر واحد لتخلل الأنسجة. لبدء النفاذية ، انقل الأنسجة مع الملقط إلى طبق آخر يحتوي على ملليلتر واحد من TP buffer ، يحتوي على 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الصابونين. ضع الطبق في شاكر صفيحة صغيرة واتركه يحرك بلطف لمدة 30 دقيقة.
ثم ، انقل الأنسجة مع الملقط إلى طبق طازج يحتوي على مخزن مؤقت MR ملليلتر واحد ، واتركه يحرك بلطف لمدة 10 دقائق. انقل الأنسجة باستخدام الملقط إلى غرفة HRR معايرة. املأ غرف HRR ب 2.1 ملليلتر من المخزن المؤقت MR.
أضف Amplex Red و peroxidase إلى تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار ، ووحدتين لكل ملليلتر ، على التوالي. ثم أضف العصب الوركي القابل للاختراق. قم بتوصيل مستشعرات الفلورسنت الخاصة بالجهاز.
ثم ، أطفئ الأضواء في قسم التحكم في البرنامج وانقر فوق الاتصال ب oxygraph"انتقل إلى تحرير البروتوكولات" في البرنامج وأدخل وزن الأنسجة. انتقل إلى التخطيط واختر خيار التدفق المحدد لكل عينة وحدة. ثم حدد المؤامرات للوصول في وقت واحد إلى قراءة استهلاك الأكسجين ، وإذا لزم الأمر ، إنتاج بيروكسيد الهيدروجين.
انتظر لمدة 10 دقائق تقريبا. حقن نبضتين من بيروكسيد الهيدروجين ، كل واحدة إلى تركيز نهائي من 260 ميكرومولار لمعايرة الغرفة. حقن 20 ميكرولتر من السكسينات ، وهي ركيزة مجمع الميتوكوندريا II ، لتنشيط نظام نقل إلكترون الميتوكوندريا.
أضف 20 ميكرولتر من ADP لتنشيط توليف ATP. في التسلسل ، أضف خمسة ميكرولترات من السيتوكروم c كمؤشر على سلامة الغشاء. معايرة مع aliquots من 0.2 ميكروغرام لكل ملليلتر من oligomycin حتى لا يلاحظ أي انخفاض آخر في استهلاك الأكسجين.
معايرة مع aliquots من 0.5 ميكرومول لكل لتر FCCP ، والميتوكوندريا غير المقترنة ، حتى لا يلاحظ أي زيادة أخرى في استهلاك الأكسجين. لإنهاء التجربة ، قم بحقن ميكرولترين من antimycin A ، وقم بتركيز نهائي قدره خمسة ملليمولات وانتظر حتى يستقر التدفق. انتقل إلى شريط الأوامر.
البحث عن الحواس المتعددة"في البرنامج. انقر فوق عنصر التحكم"ثم اضغط على حفظ الملف"وقطع الاتصال. افتح الملف المحفوظ وحدد تدفق الأكسجين لكل صواني كتلة للحصول على نتائج استهلاك الأكسجين التجريبية.
حدد النافذة يدويا بين الحقن عن طريق الضغط على زر الماوس الأيسر shift plus left. انتقل إلى العلامات، وحدد الإحصائيات لتصور النتائج لكل حقنة من الركائز والمثبطات وبروتوكول فك الاقتران. لإنتاج بيروكسيد الهيدروجين تنفيذ نفس الإجراء مع تتبع منحدر أمبير.
أدى الانخفاض في إمكانات الغشاء التي يعززها نشاط سيثاز ATP إلى تسريع استهلاك الأكسجين. إن إضافة السيتوكروم C الخارجي المنشأ لم يعزز سوى الحد الأدنى من تحفيز التنفس ، مما يشهد على سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا لهذا التحضير. تم تسجيل تدفقات الأكسجين المطلقة ولوحظ زيادة بنسبة 6.3٪ فقط في التنفس ، مما يشير إلى نوعية جيدة من إعداد الأنسجة.
تم قياس استهلاك الأكسجين وإنتاج ROS في وقت واحد في وجود ركائز مختلفة توفر الوقود لنظام نقل الإلكترون. إضافة البيروفات والمالات لمجمع الميتوكوندريا أنا زيادة التنفس. وإضافة المزيد من السكسينات للمجمع II يزيد أيضا من استهلاك الأكسجين.
لذلك يمكن اختبار ركائز أخرى. كما زاد إنتاج ROS ، مما يشير إلى تسرب الأكسجين من نظام نقل الإلكترون. أدت إضافة الأدينوسين ثنائي الفوسفات في تركيز التشبع إلى زيادة استهلاك الأكسجين مما أدى إلى تكوين ATP ، وتقليل إنتاج ROS.
في المقابل ، قللت معايرة الأوليغو من استهلاك الأكسجين وزادت من إنتاج ROS. هذا يشير إلى أن العصب الوركي المتخلل يمكن أن يكرر العلاقة القياسية في فسيولوجيا الميتوكوندريا. تؤكد إضافة FCCP والريتينون ، المتوافقة مع التغيرات المتوقعة في تدفق الأكسجين ، أن فسيولوجيا الميتوكوندريا وملف الطاقة الحيوية قد تم الحفاظ عليهما في العصب الوركي المتغلغل.
الخطوة الأكثر أهمية هي إعداد قسم الأنسجة بلطف ، وضمان تنظيف جميع فتحات الغرفة بشكل صحيح. يمكن أن تكون التعديلات في وظيفة الميتوكوندريا بسبب خلل وظيفي أو انخفاض عدد الميتوكوندريا. لذلك يوصى باستخدام نشاط synthase المذكور وتأكيد محتوى الحمض النووي للميتوكوندريا بواسطة PCR.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يسمح هذا البروتوكول بتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأنسجة العصبية عن طريق عزل الميتوكوندريا، وهي مهمة صعبة بسبب العدد المحدود لها. إنه يتيح التحليل المتزامن لاستهلاك الميتوكوندريا للأكسجين وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الموقع.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- علم الصيدلة
الخلفية
- وظيفة الميتوكوندريا ضرورية لصحة الخلايا.
- الاعتلالات العصبية، مثل تلك الناجمة عن مرض السكري من النوع الثاني أو العلاج الكيميائي، غالباً ما تنطوي على خلل في وظيفة الميتوكوندريا.
- يمكن أن تؤدي الضعف في الفسفرة المؤكسدة إلى تحديد تقدم المرض.
- فهم آليات الميتوكوندريا يمكن أن يؤدي إلى علاجات محتملة.
هدف الدراسة
- لتقييم معدلات التنفس الميتوكوندريا في الأنسجة العصبية.
- لقياس إنتاج ROS في الأعصاب الوعائية العجزية.
- لاستكشاف آليات أمراض الميتوكوندريا والعلاجات المحتملة.
الطرق المستخدمة
- قياس التنفس عالي الدقة المقترن بمستشعرات الفلورسنت.
- استخدام ركائز متعددة، مثبطات، وعوامل فك الارتباط.
- عزل الميتوكوندريا من الأنسجة العصبية.
- قياس متزامن لاستهلاك الأكسجين وتوليد ROS.
النتائج الرئيسية
- تقييم ناجح لوظيفة الميتوكوندريا في الأنسجة العصبية.
- تبين القياس المتزامن لمستويات الأكسجين وROS.
- رؤى حول دور خلل وظيفة الميتوكوندريا في الاعتلالات العصبية.
- إمكانية تطوير علاجات تستهدف صحة الميتوكوندريا.
الاستنتاجات
- يوفر هذا الأسلوب أداة قيمة لدراسة وظيفة الميتوكوندريا في الأنسجة العصبية.
- يعزز فهمنا لبيولوجيا الأعصاب وآليات المرض.
- يمكن أن تركز البحوث المستقبلية على التدخلات العلاجية للأمراض المتعلقة بالميتوكوندريا.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-resolution respirometry in permeabilized sciatic nerve enables direct, quantitative assessment of mitochondrial function in small, disease-relevant peripheral nerve samples. This approach addresses a critical gap in early discovery and target validation for neuropathy-related drug development by providing simultaneous measurement of oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) production. The method supports predictive confidence in mitochondrial dysfunction as a mechanistic driver of neuropathies, informing portfolio triage and therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial respiratory states and ROS generation in intact nerve tissue.
- Supports mechanistic de-risking for neuropathy targets by quantifying mitochondrial dysfunction.
- Facilitates functional target validation through substrate and inhibitor response profiling.
- Provides predictive confidence for mitochondrial involvement in disease progression.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative assay for mitochondrial function in peripheral nerves.
- Delivers standardized readouts for oxygen consumption and ROS production across conditions.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening targeting mitochondrial pathways.
- Enables reliable evaluation of mitochondrial modulators in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial functional readouts with neuropathy disease models for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of mitochondrial-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative mitochondrial metrics.
- Enhances predictive de-risking for therapies addressing mitochondrial dysfunction in neuropathies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling direct mitochondrial function assessment in peripheral nerve models, supporting both early mechanistic studies and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial respiratory states and ROS output to clarify disease mechanisms.
- Screening: Provides standardized, reproducible assay outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative oxygen consumption and ROS measurements for condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical neuropathy models with functional mitochondrial endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for mitochondrial assessment across neuropathy research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuropathy target validation.
- Operational Value: Standardizes mitochondrial function assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust mitochondrial data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial-targeted assets in neuropathy pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-resolution respirometry and peripheral nerve handling.
- Needs specialized instrumentation for simultaneous oxygen and ROS detection.
- Demands rigorous cross-team standardization of tissue preparation and assay protocols.
- May require adaptation for different nerve types or disease models.
- Sample size and mitochondrial content limitations must be considered for data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:19
Calibration of Polarographic Oxygen Sensors for High-Resolution Respirometry (HRR)
1:56
Dissection and Permeabilization of the Sciatic Nerve
2:58
Oxygen Consumption and Reactive Oxygen Species (ROS) Production Determination
5:51
Results: Assessing the Mitochondrial Oxygen Consumption by the Permeabilized Sciatic Nerve
7:41
Conclusion
