التحقيق في الآثار المخففة لإعطاء العصيات المخيخية على التهاب القولون من خلال تعديل ميكروبات الأمعاء

يسمح هذا البروتوكول بتقييم تأثير تنظيم ثنائي الاتجاه لمكملات بروبيوتيك على الصحة والنتائج المستقرة والقابلة للتكرار. تم إنشاء نموذج بديل لالتهاب القولون الناجم عن DSS باستخدام الفئران الزائفة الخالية من الجراثيم من أجل تجنب بعض القيود المختبرية في استخدام الفئران الخالية من الجراثيم كمستقبلات للبروبيوتيك. لاستكشاف الآثار المفيدة للبروبيوتيك في هذه التقنية, انها نهج واعد لتطوير استراتيجيات العلاج الجديدة للتخفيف من أعراض الاضطرابات المرتبطة بالالتهابات المزمنة.

للبدء ، قم بإعداد مزيج من المضادات الحيوية عن طريق إذابة الأمبيسلين وكبريتات النيومايسين والميترونيدازول والفانكومايسين في مياه الشرب. بعد الذوبان الكامل ، قم بتخزين المحاليل عند أربع درجات مئوية. ضع محاليل كوكتيل المضادات الحيوية في زجاجة ماء.

تأكد من استخدام زجاجات بنية اللون أو لف الزجاجات بورق الألمنيوم لحماية محاليل المضادات الحيوية من الضوء. ضع الزجاجة فوق قفص الماوس. لصنع محلول كبريتات ديكستران الصوديوم بنسبة 2.5٪ ، قم بإذابة 2.5 جرام من DSS في 100 مل من الماء المقطر.

استبدل مياه الشرب بمحلول DSS 2.5٪ في مجموعة الفئران النموذجية لالتهاب القولون. لتقييم التأثير الإيجابي ل B cereus على التخفيف من التهاب القولون ، قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي إلى المجموعات الثلاث التالية ، المجموعة الضابطة ، ونموذج التهاب القولون الناجم عن DSS ، ومكملات بروبيوتيك B cereus للفئران التي يسببها DSS. لاستكشاف دور ميكروبات الأمعاء في تنظيم تأثيرات البروبيوتيك من B cereus على التهاب القولون الناجم عن DSS ، قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي إلى المجموعات الثلاث التالية ، ABX / control و ABX / DSS و ABX / B cereus بالإضافة إلى DSS.

سجل وزن جسم الفئران كوزن أساسي بعد إعطاء كوكتيل المضادات الحيوية. عالج على الفور ذكر C 57 BL ستة فئران بمحلول 2.5٪ DSS في مياه الشرب لمدة سبعة أيام. قم بإعداد ثمانية أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 مليلتر مملوءة ب 900 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي المعقم.

ماصة 100 ميكرولتر من النمو اللوغاريتمي B cereus وتذوب في 900 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي المعقم. تمييع B المخيخية بشكل متسلسل باستخدام الأنابيب. صفيحة 40 ميكرولتر من كل تخفيف على لوحة أجار LB المعنية المسماة بنسبة التخفيف.

كرر ثلاث مرات لكل نسبة تخفيف. قم بزراعة الألواح في حاضنة درجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. حدد اللوحات التي تحتوي على ما يقرب من 20 إلى 70 مستعمرة للعد.

بعد القياس الكمي ل B cereus ، اجمع مليلتر واحد من وسط B cereus يحتوي على واحد في 10 إلى CFU التاسع وجهاز طرد مركزي عند 8 ، 000 جم لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الخلايا البكتيرية مرتين بالماء المعقم عن طريق الطرد المركزي عند 8،000 جم لمدة 10 دقائق وإزالة المادة الطافية. خفف المخيخ B المركز بمحلول ملحي عادي معقم إلى تركيز نهائي يبلغ اثنين في 10 إلى CFU الثامن لكل 200 ميكرولتر.

ماصة التخفيف لأعلى ولأسفل بشكل متكرر للحصول على تعليق B cereus مشتت. امسح الجزء الخارجي من إبرة التزقيم بنسبة 70٪ من الإيثانول وحافظ على تطبيق الجرعة المناسبة. لكبح جماح الفئران ، التقطها من ذيلها وأمسك الجلد المترهل للظهر بقوة مع تثبيت نهاية الذيل بين آخر إصبعين للمعالج.

احتفظ بالفئران في وضع رأسي. ثم أدخل إبرة التزقيم بعناية وبلطف من خلال الفم في المريء. قم بإدارة محلول المخيخ B ، واسحب الإبرة برفق ، وأعد الفأر إلى قفصه.

قم بقياس وزن جسم الفئران يوميا واجمع عينات البراز على الفور في أنبوب طرد مركزي معقم. تحديد الدم الخفي في البراز عن طريق ورقة اختبار الدم الخفي في البراز. اجمع 10 ملليغرام من عينة البراز على عصا قضيب.

ضع العينة على بطاقة الاختبار وقم بتطبيق مسحة رقيقة على البطاقة. افتح الغطاء الخلفي وقم بتطبيق المطور على اللطاخة. ثبت الفئران مستلقية على طاولة العمليات وافتح التجويف البريتوني.

افصل القولون بالكامل جراحيا وقم بقياس الطول بمسطرة. ثم اغسل القولون برفق بحقنة سعة خمسة ملليلتر مملوءة ب PBS المبردة مسبقا. إزالة الشمع وترطيب أقسام القولون.

بعد ذلك ، قم بتلطيخ أقسام القولون بالهيماتوكسيلين واليوزين. دع اثنين من المجربين المستقلين يقيمان الدرجات النسيجية للعينة تحت المجهر الضوئي ، وكشف تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين أن أنسجة القولون للفئران النموذجية لالتهاب القولون أظهرت فقدان القبو ، وتلف خلايا الكأس ، وتسلل الخلايا الالتهابية ، وفقدان الظهارة. ب العلاج المخيخي تحسين DSS الناجم عن الضرر النسيجي المرضي.

كانت الدرجات النسيجية المرضية لفئران التهاب القولون أعلى بكثير مما كانت عليه في المجموعة الضابطة. ومع ذلك ، كانت الدرجات النسيجية المرضية في مجموعة B cereus أقل بكثير مما كانت عليه في فئران التهاب القولون. تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات ، كانت درجات فقدان وزن الجسم ، ودرجات DAI ، ودرجات علم الأنسجة المرضية أعلى وكان طول القولون أقصر في مجموعة ABX / DSS مقارنة بالفئران في مجموعة ABX / التحكم.

لم يكن فقدان وزن الجسم ، وطول القولون ، ودرجات DAI ، ودرجات علم الأنسجة المرضية مختلفا إحصائيا بين مجموعات ABX / DSS و ABX / B cereus بالإضافة إلى DSS. تشير النتائج الحالية بشكل غير مباشر إلى أن ميكروبات الأمعاء تلعب دورا رئيسيا في الآثار الإيجابية ل B cereus على التهاب القولون. تتمثل إحدى أهم الخطوات في استخدام Bacillus cereus بطريقة التزقيم لبناء نمذجة التهاب القولون في الفئران.

أدى علاج Bacillus cereus إلى القضاء على التهاب القولون الناجم عن DSS ، مما أدى إلى أساس دراسة متابعة البروبيوتيك لعلاج التهاب القولون.