Name: التحليل الطيفي لقوة المجموعة بواسطة قوى القص (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: استكشف التحليل الطيفي لقوة المجموعة لدراسة تفاعلات الربط بين الحمض النووي والربيطات باستخدام تقنية الإنتاجية العالية. تتيح هذه الطريقة تتبع التغيرات الفلورية بدقة في الوقت الفعلي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل البحثي من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم [CBET-1904921] والمعاهد الوطنية للصحة [NIH R01CA236350] إلى H. M.

ملاحظة: يتم سرد جميع المخازن المؤقتة والكواشف الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول في مواد الجدول.
1. إعداد مجهر قوة القص
ملاحظة: يحتوي مجهر قوة القص على جزأين، وحدة تفاعل (مجانس) ووحدة كشف (مجهر فلوري). تكبير العدسة هو 10x ، وتكبير العدسة الموضوعية (الهواء) هو 4x.
<ol><li>قم بتجميع المجانس والمجهر على طاولة تركيب. ارتد نظارات واقية وقم بتشغيل المجهر الفلوري ، ثم اضبط المجانس للتأكد من أن شعاع ضوء الإثارة ذي الطول الموجي المناسب (هنا ، تم استخدام 488 نانومتر) يمر عبر مركز طرف التشتت للمجانس.</li>
	<li>قم بإعداد غرفة تفاعل مسطحة القاع يبلغ ارتفاعها 5 سم و 1.5 سم 2 × 1.5 سم2 في المقطع العرضي. لتقليل الخلفية ، تأكد من أن مادة الغرفة المحددة لا تتألق ، مثل النظارات (بعض المواد البلاستيكية لها تألق).</li>
	<li>اختر طرف تشتيت مجانس مناسب يمكنه توفير قوة القص المطلوبة. ملاحظة: يعتمد معدل القص على المسافة بين الدوار والجزء الثابت بسرعة دوران ثابتة11 وفقا للمعادلة التالية: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63741/63741eq01.jpg" style="margin: auto;"> حيث μ هي اللزوجة الديناميكية للمياه عند 20 درجة مئوية ؛ D هو القطر الداخلي للجزء الثابت. d هو القطر الخارجي للدوار ، و V هو سرعة القص (دورة في الدقيقة / ثانية).</li>
	<li>قم بتثبيت غرفة التفاعل في مرحلة العينة من المجهر الفلوري ، ثم اضبط الغرفة لتثبيت طرف التشتت للمجانس (الشكل 1). تأكد من أن طرف التشتت أعلى قليلا (~ 1 مم) من السطح السفلي لغرفة التفاعل.</li>
	<li>اضبط الوضع الرأسي للمجانس والغرفة معا لضمان تركيز المجهر على سطح طرف التشتت. بعد ذلك، اضبط الموضع الأفقي لطرف التشتت للتأكد من تعيين منطقة الكشف (مجال الرؤية) بين الدوار والجزء الثابت (الشكل 1).</li>
	<li>قم بتشغيل قنوات التألق وفقا لصبغة الفلورسنت المستخدمة في التجربة.</li>
	<li>قبل تجربة القص عالية السرعة، استخدم الماء منزوع الأيونات (DI) لاختبار القص بسرعة قص منخفضة (على سبيل المثال، 2000 دورة في الدقيقة) لضمان عمل طرف التشتت بشكل مناسب دون لمس غرفة التفاعل.</li>
</ol>2. تتكشف i-motifs مع وبدون روابط
<ol><li>قم بإعداد الحمض النووي البشري للتيلوميريك i-motif (جدول المواد) الموسوم بصبغة ومبرد في طرفيه ، على التوالي ، في مياه DI ، كما هو موضح في Hu et al.11. ملاحظة: I-MOMOTIF يحتوي على تسلسل: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.</li>
	<li>قم بتخفيف الحمض النووي إلى 5 ميكرومتر في المخزن المؤقت MES 30 mM عند درجة الحموضة 5.5 أو الرقم الهيدروجيني 7.4. إلى محلول الحمض النووي ، أضف الليغاند L2H2-4OTD ، الذي تم تصنيعه وفقا ل Abraham Punnoose et al.13 ، في نطاق تركيز يتراوح بين 0-60 ميكرومتر.</li>
	<li>تحقق من شدة التألق الخلفية لغرفة التفاعل المملوءة بماء DI منزوع الأيونات وقلل من شدته باستخدام المجهر الفلورسنت دون قص. طريقة سهلة لتقليل التألق في الخلفية هي غسل غرفة التفاعل بماء DI. يجب طرح قيمة التألق الخلفية في تحليلات البيانات لاحقا. ملاحظة: يجب تجنب الضوء الضال من هذه الخطوة فصاعدا.</li>
	<li>قم بتعيين معلمات كاميرا CCD باستخدام البرنامج. المعلمات الموصى بها هي كما يلي: وقت التعرض = 0.5 ثانية ، حساسية CCD = 1600 ، ووقت التسجيل = 20 دقيقة.</li>
	<li>باستخدام ماصة طويلة ، أضف محلول الحمض النووي إلى غرفة التفاعل الفارغة والنظيفة. قم بتغطية غرفة التفاعل بصندوق أسود. بعد ذلك، ابدأ تشغيل المجانس لإجراء القص بمعدل قص محدد يتراوح من 9,724 s−1 إلى 97,245 s−1 (تم تحديده باستخدام البرنامج المرتبط بالمجانس) لمدة 20 دقيقة مع تشغيل كاميرا CCD لتسجيل البيانات.</li>
	<li>بعد التجربة ، قم بإزالة الغرفة واغسلها بماء DI.</li>
</ol>3. تفاعل النقر الذي يتم تشغيله بقوة القص
<ol><li>تحضير الحمض النووي i-motif في الماء DI. احتضان 10 ميكرومتر من الحمض النووي i-motif في 300 ميكرولتر من 30 mM Tris buffer (الرقم الهيدروجيني 7.4) مع استكمال 150 μM CuCl و 300 μM حمض الأسكوربيك لمدة 10 دقائق لطي هياكل i-motif (جميع التركيزات هي تركيزات نهائية في المحلول). ملاحظة: CuCl هو محفز تفاعل النقر. حمض الأسكوربيك سيمنع أكسدة النحاس (I).</li>
	<li>قم بترشيح المحلول باستخدام جهاز الترشيح الفائق بقوة طرد مركزي تبلغ 14,300 × جم. قم بتجديد المحلول إلى ~ 500 ميكرولتر باستخدام مخزن مؤقت Tris 30 mM (الرقم الهيدروجيني 7.4) مع استكمال حمض الأسكوربيك 300 ميكرومتر بعد كل ترشيح.</li>
	<li>كرر الترشيح 3x.</li>
	<li>جمع الحل المتبقي وجعل حجم نهائي من 300 ميكرولتر عن طريق إضافة 30 mM Tris (الرقم الهيدروجيني 7.4) مع استكمال حمض الأسكوربيك 300 μM جنبا إلى جنب مع 20 μM Calfluor 488 azide ، 20 μM HPG ، و 10 μM TBTA. بمجرد إضافة الكواشف ، انقل المحلول إلى الغرفة المظلمة. ملاحظة: يجب تجنب الضوء بعد هذه الخطوة.</li>
	<li>تحقق من شدة التألق الخلفية لغرفة التفاعل المملوءة بماء DI وقللها إلى الحد الأدنى باستخدام المجهر قبل تجارب القص. طريقة سهلة لتقليل التألق في الخلفية هي غسل غرفة التفاعل بماء DI.</li>
	<li>أضف محلول الحمض النووي إلى غرفة التفاعل الفارغة باستخدام ماصة طويلة، ثم ابدأ قص المجانس بمعدل قص 63,209 s−1 لمدة 20 دقيقة مع تشغيل كاميرا CCD.</li>
	<li>بعد التجربة ، قم بإزالة الغرفة واغسلها بماء DI.</li>
</ol>

<ol><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+Optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li>
<li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+strong+is+a+covalent+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li>
<li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li>
<li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026(2016).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li>
<li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility%3A+Force-induced+collagen+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li>
<li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li>
<li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li>
<li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells%3A+go+with+the+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li>
<li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li>
<li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li>
<li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li>
<li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li>
<li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mechanochemical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

يسمح البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة بالتحقيق في الوقت الفعلي في تكشف مجموعة من الهياكل الجزيئية الحيوية بواسطة قوة القص. تؤكد النتائج المعروضة هنا أن هياكل الحمض النووي i-motif يمكن أن تتكشف بواسطة قوة القص. كان الكشف عن i-motif المرتبط بالرباط وتفاعلات النقر التي تحركها قوة القص تطبيقات إثبات المفهوم لطريقة التحليل الطيفي لقوة المجموعة هذه.
يعرض الشكل 1 إعداد الأداة. يجب ألا يتلامس طرف مولد المجانس وغرفة التفاعل مع بعضهما البعض ، وهو أمر بالغ الأهمية للسماح ب...

في التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد1 (SMFS) ، تمت دراسة الخواص الميكانيكية للهياكل الجزيئية الفردية بواسطة أدوات متطورة مثل مجهر القوة الذرية والملقط البصري والملقط المغناطيسي2،3،4. مقيدة بنفس متطلبات الاتجاه للجزيئات في إعدادات توليد / اكتشاف القوة أو مجال الرؤية الصغير في الملقط المغناطيسي ومجهر قوة الطرد المركزي المصغر (MCF) 5،6،7،8 ، يمكن التحقيق في عدد محدود فقط من الجزيئات في وقت واحد باستخدام SMFS. تمنع الإنتاجية المنخفضة ل SMFS تطبيقه على نطاق واسع في مجال التعرف الجزيئي ، مما يتطلب مشاركة مجموعة كبيرة من الجزيئات.
يوفر تدفق القص حلا محتملا لتطبيق القوى على مجموعة ضخمة من الجزيئات9. في تدفق السائل داخل القناة ، كلما اقتربت من سطح القناة ، كلما كان معدل التدفق أبطأ10. يسبب تدرج سرعة التدفق هذا إجهاد قص مواز لسطح الحدود. عندما يتم وضع جزيء في تدفق القص هذا ، يعيد الجزيء توجيه نفسه بحيث يتوافق محوره الطويل مع اتجاه التدفق ، حيث يتم تطبيق قوة القص على المحور الطويل11. نتيجة لإعادة التوجيه هذه ، من المتوقع أن تتماشى جميع الجزيئات من نفس النوع (حجم وطول المقابض) في نفس الاتجاه بينما تواجه نفس قوة القص.
يصف هذا العمل بروتوكولا لاستخدام تدفق القص هذا لممارسة قوة القص على مجموعة ضخمة من الهياكل الجزيئية ، كما يتضح من الحمض النووي i-motif. في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء تدفق قص بين الدوار والجزء الثابت في طرف مجانس. وجدت هذه الدراسة أن بنية الحمض النووي المطوية i-motif يمكن أن تتكشف من خلال معدلات القص 9724-97245 s−1. إلى جانب ذلك ، تم العثور على ثابت تفكك يبلغ 36 ميكرومتر بين الرباط L2H2-4OTD و i-motif. وتتفق هذه القيمة مع قيمة 31 ميكرومتر المقاسة بمقايسة إزاحة الهلام12. علاوة على ذلك ، يتم استخدام التقنية الحالية لكشف شكل i-motif ، والذي يمكن أن يعرض النحاس المخلبي (I) لتحفيز تفاعل النقر. وبالتالي يسمح هذا البروتوكول للمرء بالكشف عن مجموعة كبيرة من هياكل i-motif مع أدوات منخفضة التكلفة في وقت معقول (أقصر من 30 دقيقة). بالنظر إلى أن تقنية قوة القص تزيد بشكل كبير من إنتاجية التحليل الطيفي للقوة ، فإننا نسمي هذه التقنية التحليل الطيفي لقوة مجموعة (EFS). يهدف هذا البروتوكول إلى توفير مبادئ توجيهية تجريبية لتسهيل تطبيق نظام EFS القائم على قوة القص.

<table><tbody><tr><td>3K MWCO Amicon</td><td>Millipore Sigma</td><td>ufc900324</td><td></td></tr><tr><td>حمض الأسكوربيك</td><td>VWR</td><td>VWRC0143-100G</td><td></td></tr><tr><td>Calfluor 488 azide</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1369-1</td><td></td></tr><tr><td>CuCl</td><td>Thermo &nbsp ؛</td><td>ACRO270525000</td><td></td></tr><tr><td>طرف التشتت</td><td>سويسرا</td><td>PT-DA07 / 2EC-B101</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>صبغ</td><td>IDT</td> <td>/ 5Cy5 /</td><td></td></tr> <tr><td>مجهر مضان</td><td>Janpan</td><td>Nikon TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>الخالط</td><td>سويسرا</td><td>PT 3100D</td><td></td></tr><tr><td>HPG</td><td>سانتا كروز التكنولوجيا</td> <td>الحيويةcs-295271</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>VWRC26760.295</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>VWR</td><td>VWRCE169-500G</td><td></td></tr><tr><td>Quencher</td><td>IDT</td> <td>/ 3IAbRQSp /</td><td></td></tr> <tr><td>TBTA</td><td>طوكيو للصناعة الكيميائية</td><td>T2993</td><td></td></tr><tr><td>تريس</td><td>VWR</td><td>VWRCE133-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

التحليل الطيفي لقوة المجموعة بواسطة قوى القص

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

توفر تقنيات الجزيء الواحد القائمة على مبادئ التألق والميكانوكيميائية حساسية فائقة في الاستشعار البيولوجي. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود قدرات إنتاجية عالية ، فإن تطبيق هذه التقنيات محدود في الفيزياء الحيوية. أظهر التحليل الطيفي لقوة المجموعة (EFS) إنتاجية عالية في التحقيق في مجموعة ضخمة من الهياكل الجزيئية عن طريق تحويل الدراسات الميكانيكية الكيميائية للجزيئات الفردية إلى دراسات المجموعات الجزيئية. في هذا البروتوكول ، تم الكشف عن الهياكل الثانوية للحمض النووي (i-motifs) في تدفق القص بين الدوار والجزء الثابت لطرف مجانس بمعدلات قص تصل إلى 77796 / ثانية. تم توضيح آثار معدلات التدفق والأحجام الجزيئية على قوى القص التي تعاني منها i-motif. كشفت تقنية EFS أيضا عن تقارب الارتباط بين زخارف الحمض النووي i-motifs والأربطة. علاوة على ذلك ، أظهرنا تفاعل كيمياء النقر الذي يمكن تشغيله بواسطة قوة القص (أي كيمياء النقر الميكانيكي). تثبت هذه النتائج فعالية استخدام قوة القص للتحكم في تشكيل الهياكل الجزيئية.

يوضح الشكل 1 التكشف الميكانيكي والاستشعار في الوقت الفعلي لجزيئات المجموعة في EFS. في الشكل 1B، لوحظ أن شدة التألق للحمض النووي i-motif تزداد مع معدل القص الذي يتراوح من 9,724 s−1 إلى 97,245 s−1 في مخزن مؤقت للأس الهيدروجيني 5.5 MES. كعنصر تحكم ، لم يتم زيادة شدة التألق عندما تم قص نفس الحمض النووي i-motif بمعدل 63,209 s−1 في مخزن مؤقت للأس الهيدروجيني 7.4 MES. وذلك لأن i-motif لا يطوى عند الرقم الهيدروجيني 7.4<...

التحليل الطيفي لقوة المجموعة (EFS) هو تقنية قوية للتكشف الميكانيكي والاستشعار في الوقت الفعلي لمجموعة من الهياكل الجزيئية الحيوية في المجالات الفيزيائية الحيوية والاستشعار الحيوي.

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

يوفر هذا البروتوكول تقنية إنتاجية عالية لدراسة الارتباط بين الجزيئات بين الحمض النووي والأربطة. وقد أظهرت هذه التقنية إنتاجية عالية في التحقيق في مجموعة ضخمة من الهياكل الجزيئية الحيوية. وهو يفعل ذلك عن طريق تحويل الخواص الكيميائية الميكانيكية للجزيئات الفردية إلى تلك الخاصة بالمجموعات الجزيئية.أعتقد أنها تجربة خطوة إلى الأمام ولكن هناك القليل من الخطوات الحاسمة. على سبيل المثال ، محاذاة المجهر ، المجانس ، وأنبوب التفاعل. يجب محاذاة هذه الأشياء الثلاثة تماما من أجل تتبع التغيير في التألق بدقة.ابدأ بتجميع المجانس والمجهر على طاولة تركيب. بعد ارتداء نظارات واقية ، قم بتشغيل المجهر الفلوري ثم اضبط المجانس للتأكد من أن شعاع ضوء الإثارة يمر عبر مركز الطرف المشتت للمجانس. ثم قم بإعداد غرفة تفاعل مسطحة القاع يبلغ ارتفاعها خمسة سنتيمترات و 1.5 × 1.5 سم مربع في المقطع العرضي ، مما يضمن عدم تألق مادة الغرفة المحددة لتقليل الخلفية.بعد ذلك ، قم بتثبيت غرفة التفاعل على مرحلة العينة من المجهر الفلوري ثم اضبط الغرفة لعقد طرف التشتت للمجانس ، مما يضمن أن الطرف أعلى قليلا من السطح السفلي لغرفة التفاعل. بعد ذلك ، اضبط الوضع الرأسي للمجانس والغرفة معا لضمان تركيز المجهر على سطح طرف التشتت. ثم اضبط الوضع الأفقي لطرف التشتت للتأكد من ضبط منطقة الكشف بين الدوار والدولتر.قم بتشغيل قنوات الفلورسنت ، وفقا لصبغة الفلورسنت المستخدمة في التجربة. قبل تجربة القص عالية السرعة ، استخدم الماء منزوع الأيونات لاختبار القص بسرعة قص منخفضة. أولا، قم بإعداد الحمض النووي البشري للتيلوميريك i-motif المسمى بصبغة ومبرد في طرفيه على التوالي في الماء منزوع الأيونات كما هو موضح في المخطوطة.بعد ذلك ، قم بتخفيف الحمض النووي إلى خمسة ميكرومولير في مخزن MES مؤقت 30 ملليمولار عند درجة الحموضة 5.5 أو درجة الحموضة 7.4. إلى محلول الحمض النووي ، أضف الليجند L2H24OTD"في نطاق تركيز من صفر إلى 60 ميكرومولار واخلط المحلول بلطف لمدة 10 دقائق لطي هياكل i-motif بدون ضوء. تحقق من شدة التألق الخلفية لغرفة التفاعل المملوءة بالماء منزوع الأيونات وقلل منها باستخدام المجهر الفلوري دون قص.ثم قم بتعيين معلمات كاميرا CCD باستخدام البرنامج مع وقت التعرض على أنه 0.5 ثانية ، وحساسية CCD من 1،600 ، ووقت التسجيل يساوي 20 دقيقة. باستخدام ماصة طويلة ، أضف محلول الحمض النووي إلى غرفة التفاعل الفارغة والنظيفة وقم بتغطية غرفة التفاعل بصندوق أسود. ثم ابدأ تشغيل المجانس لإجراء القص بمعدل قص محدد يتراوح من 9،724 في الثانية إلى 97،245 في الثانية لمدة 20 دقيقة ، مع تشغيل كاميرا CCD لتسجيل البيانات.بعد التجربة ، قم بإزالة الغرفة واغسلها بالماء منزوع الأيونات. تحضير الحمض النووي i-motif والماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، احتضن 10 ميكرومولار i-motif DNA و 300 ميكرولتر من 30 ملليمولار تريس العازلة مع استكمال 150 كلوريد كوبريك ميكرومولار و 300 حمض الأسكوربيك ميكرومولار لمدة 10 دقائق لطي هياكل i-motif.بعد ذلك ، قم بترشيح المحلول باستخدام جهاز ترشيح فائق بقوة طرد مركزي تبلغ 14،300 مرة G.قم بتجديد المحلول إلى ما يقرب من 500 ميكرولتر مع مخازن ترايس ثلاثية 30 ملليمولار مكملة ب 300 من حمض الأسكوربيك المولي الدقيق بعد كل ترشيح. بعد جمع المحلول المتبقي ، قم بعمل حجم نهائي قدره 300 ميكرولتر عن طريق إضافة 30 ملليمولار تريس مكمل ب 300 من حمض الأسكوربيك المولي إلى جانب 20 ميكرومولار CalFluor 488 Azide و 20 micromolar HPG و 10 micromolar TBTA. بمجرد إضافة الكواشف ، انقل المحلول إلى الغرفة المظلمة.ثم تحقق من شدة التألق الخلفية لغرفة التفاعل المملوءة بالماء منزوع الأيونات وقم بتقليلها باستخدام المجهر قبل تجارب القص. بعد ذلك ، أضف محلول الحمض النووي إلى غرفة التفاعل الفارغة باستخدام ماصة طويلة ، ثم ابدأ قص المجانس بمعدل قص 63،209 في الثانية لمدة 20 دقيقة مع تشغيل كاميرا CCD. بعد التجربة ، قم بإزالة الغرفة واغسلها بالماء منزوع الأيونات.وقد لوحظ أن كثافة التألق في الحمض النووي i-motif تزداد مع المعدل الهائل الذي يتراوح من 9،724 في الثانية إلى 97،245 في الثانية في مخزن مؤقت للأس الهيدروجيني 5.5 MES. ومع ذلك ، لم يتم زيادة شدة التألق عندما تم قص نفس الحمض النووي i-motif بمعدل 63،209 في الثانية ، لأنه لا يطوى عند درجة الحموضة 7.4 في المخزن المؤقت MES. تم تقييم ارتباط الليغاند بجزيئات الحمض النووي i-motif المعرضة للتدفق الهائل الذي أظهر أن زيادة شدة التألق أصبحت أقل وضوحا مع زيادة تركيز الليغاند.تم تحديد ثابت التفكك للتفاعل بين الليغاند و i-motif ووجد أنه 34 ميكرومول. تم الكشف عن شكل i-motif المخلبي للنحاس بمعدل 63،209 في الثانية ، وأثار النحاس الذي تم إطلاقه تفاعل النقر الفلورجيني ، مما أدى إلى زيادة شدة التألق بمرور الوقت. أولا ، تأكد من تعيين منطقة الكشف بين الدوار و stater.ثانيا ، تحقق من خلفية التألق وقللها. وأخيرا ، تأكد من تصفية التفاعل قبل إجراء تفاعل النقر. تفتح هذه الطريقة بوابة لاستكشاف القوة الميكانيكية ، قابلة للطي وتتكشف عن جميع أنواع البوليمرات.يمكن أن يكون هياكل الحمض النووي الأخرى ، والبروتينات ، أو البوليمرات الأخرى ، وتفاعلها مع أنواع أخرى من الجزيئات. كما قيل ، يمكن دراسة العديد من الجزيئات الكبيرة الأخرى باستخدام هذا النهج.

ensemble-force-spectroscopy-by-shear-forces

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

هذا هو خطوة خطوة دليل يبين الغرض ، والعملية ، والنتائج ممثل عن مطياف قوة الجاذبية الرواية.

مما يدل على استخدامات مطياف الرواية قوة الجاذبية على التمدد وقياس البروتينات الليفية

&lt; p class = "jove_content" &gt; السليلوزومات عبارة عن مجمعات متعددة الإنزيمات مصممة لهضم السليلوز. تم استخدام SMFS المستند إلى AFM لدراسة الخواص الميكانيكية والتكوين القابل للطي لتجميعات البروتين المرتبطة بالسليلوزوم. نقدم سير عمل كامل لتثبيت البروتين ، والحصول على البيانات ، وتحليل البيانات لدراسة تفاعلات مجمعات المستقبلات الفردية المشاركة في تجميع السليلوزوم.

التحقيق في أنظمة مستقبلات الترابط في السليلوسوم باستخدام التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد القائم على AFM

تم تطوير خلية القص للقياسات زاوية صغيرة تشتت النيوترونات في الطائرة سرعة التدرج-سرعة القص ويستخدم لوصف السوائل المعقدة. قياسات حل مكانيا في الاتجاه التدرج سرعة ممكنة لدراسة المواد القص النطاقات. وتشمل التطبيقات التحقيقات من التفرق الغروية، حلول البوليمر، والهياكل الذاتي تجميعها.

قياس المواد المجهرية تحت التدفق باستخدام الطائرة 1-2 التدفق الصغيرة زاوية تشتت النيوترونات

نحن وصف إجراءات مفصلة واستراتيجيات لقياس الخواص الميكانيكية والميكانيكية مسارات تتكشف من الجزيئات البروتينية مفرد باستخدام مجهر قوة ذرية. ونحن أيضا إظهار نتائج الممثل كمرجع للتحديد وتبرير لتسجيلات جزيء بروتين واحد جيد.

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

يصف هذا البروتوكول تجميد التساهمية من البروتينات مع سيلاني هيتيروبيفونكشونال اقتران وكيل للأسطح أكسيد السيليكون مصممة للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد مجهرية على أساس القوة الذرية الذي يتجلى تفاعل ررجا (تلميح الهياكل-1 أدهيسين من الرئوية س) مع فيبرونيكتين.

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

نقدم بروتوكول مفصل يبين كيفية تنفيذ ريولوجيا القص متذبذبة غير الخطية على مواد لينة، وكيفية تشغيل تحليل SPP-لاوس لفهم الاستجابات كتسلسل عمليات الفيزيائية.

دراسة استجابة متذبذبة القص السعة الكبيرة من مواد لينة

ويصف البروتوكول الإجراءات اللازمة للحصول علي صور التصوير المقطعي (CT) عاليه الاستبانة المكانية للتربة الحبيبية اثناء الضغط ثلاثي المحاور ، ولتطبيق تقنيات معالجه الصور علي هذه الصور المقطعية لاستكشاف السلوك الميكانيكي علي نطاق الحبوب التربة تحت التحميل.

التصور من الفشل والسلوك الميكانيكية المرتبطة الحبوب علي نطاق التربة الحبيبية تحت القص باستخدام Synchrotron الاشعه السينية الدقيقة التصوير المقطعي

نقدم بروتوكولًا لشل الجزيئات الكبيرة المفردة في الأجهزة الميكروفلويدية وتحديد التغيرات في التشكيلات تحت تدفق القص. هذا البروتوكول مفيد لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية والوظيفية للجزيئات الحيوية مثل البروتينات والحمض النووي في بيئة التدفق.

توصيف التغيرات التشكيلية أحادية الجزيء تحت تدفق القص مع المجهر الفلوري

التعلق التكافؤ من جزيئات التحقيق إلى المجهر القوة الذرية (AFM) نصائح cantilever هو تقنية أساسية للتحقيق في خصائصها الفيزيائية. وهذا يسمح لنا لتحديد قوة التمدد، وقوة الامتزاز وطول البوليمرات عن طريق مطياف قوة جزيء واحد المستندة إلى AFM مع استنساخ عالية.

مرفق التكافؤ من جزيئات واحدة للتنظير الطيفي للقوة المستندة إلى AFM

يظهر هنا بروتوكول شامل لإجراء تجارب مشبك قوة فائقة السرعة على محركات الميوسين -5 المعالجة ، والتي يمكن تمديدها بسهولة لدراسة فئات أخرى من المحركات العملية. يفصل البروتوكول جميع الخطوات اللازمة ، من إعداد الجهاز التجريبي إلى إعداد العينات والحصول على البيانات وتحليلها.

تشريح الخصائص الميكانيكية الأنزيمية للميوسينات العملية باستخدام التحليل الطيفي فائق السرعة لقوة المشبك

هنا ، نصف إعداد ملقط مغناطيسي عالي السرعة يقوم بإجراء قياسات ميكانيكية نانوية على جزيئات حيوية حساسة للقوة بمعدل أقصى يبلغ 1.2 كيلو هرتز. نقدم تطبيقه على دبابيس شعر الحمض النووي ومجمعات SNARE كأنظمة نموذجية ، ولكنه سيكون قابلا للتطبيق أيضا على الجزيئات الأخرى المشاركة في الأحداث الميكانيكية البيولوجية.

ملاقط مغناطيسية عالية السرعة للقياسات الميكانيكية النانوية على العناصر الحساسة للقوة

استكشف التحليل الطيفي لقوة المجموعة لدراسة تفاعلات الربط بين الحمض النووي والربيطات باستخدام تقنية الإنتاجية العالية. تتيح هذه الطريقة تتبع التغيرات الفلورية بدقة في الوقت الفعلي.

التحليل الطيفي لقوة المجموعة بواسطة قوى القص

استكشف المزيد من الفيديوهات