تحضير البروتينات أحادية الخلية لتحليل قياس الطيف الكتلي باستخدام تحلل الحرارة بالتجميد وحامل متساوي الضغط

يمكن ل SCoPE2 تحديد كمية آلاف البروتينات من آلاف خلايا الثدييات المفردة بدون أجسام مضادة. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الكشف عن عدم تجانس البروتين الذي قد يكون غير مرئي للتحليلات بالجملة. تم تصميم البروتينات أحادية الخلية ، باستخدام نهج SCoPE2 ، لتكون في متناول الباحثين مع مجموعة من الموارد ، من مجرد ماصة ، إلى روبوتات مناولة السوائل.

SCoPE2 قابل للتطبيق على نطاق واسع في العديد من مجالات البحث ، بما في ذلك السرطان والمناعة ، من خلال توفير نظرة ثاقبة حول كيفية اختلاف البروتينات في الوفرة بين الخلايا المفردة من نفس السكان. للبدء ، ابدأ إجراء تحلل الخلية عن طريق وضع لوحة 384 بئرا مع خلايا مفردة مرتبة في جهاز التدوير الحراري ، وتسخينها لمدة 10 دقائق عند 90 درجة مئوية متبوعة بالتبريد عند 12 درجة مئوية. قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة في لوحة دوارة منضدية عند 18 إلى 22 درجة مئوية.

سونيك لوحة لمدة خمس دقائق في سونيكاتور حمام مائي في 18 إلى 22 درجة مئوية. ثم ضعه على الثلج. للمضي قدما في هضم التربسين ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من المزيج الرئيسي وأضف 0.2 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل بئر من لوحة 384 بئر باستخدام معالج سائل.

أغلق اللوحة ، دوامة لمدة خمس ثوان ، وقم بتدويرها لأسفل في دوار لوحة منضدية عند 18 إلى 22 درجة مئوية. سخني لوحة 384 بئرا لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية مع ضبط درجة حرارة الغطاء على 52 درجة مئوية. لضبط تفاعل وسم الكتلة الترادفية، أخرج مخزون 85 ملليمولار من علامات الكتلة الترادفية من المجمد الذي تبلغ درجة حرارته 80 درجة سلزية تحت الصفر.

قبل فتحها ، قم بتسخين الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتخفيف الملصقات إلى 22 ملي مول في الأسيتونيتريل اللامائي. باستخدام استراتيجية وضع العلامات هذه ، أضف 0.5 ميكرولتر من علامات الكتلة الترادفية المخففة إلى كل بئر من لوحة البئر البالغ عددها 384 بئرا ، باستخدام روبوت توزيع السوائل أو ماصة يدوية. أغلق اللوحة ، دوامة لمدة خمس ثوان ، وقم بتدويرها لأسفل في دوار لوحة منضدية عند 18 إلى 22 درجة مئوية.

دع تفاعل وضع العلامات يستمر عند 18 إلى 22 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لتبريد تفاعل وضع العلامات على الكتلة الترادفية ، أضف 0.2 ميكرولتر من 0.5٪ هيدروكسيلامين ، مخفف في ماء بدرجة HPLC ، إلى كل بئر من لوحة البئر 384 باستخدام معالج سائل. أغلق الطبق ، دوامة لمدة خمس ثوان ، وقم بتدويره لأسفل في دوار لوحة منضدة قبل الحفاظ على اللوحة عند 18 إلى 22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

يبدأ إعداد تحليل LC-MS عن طريق إزالة الناقل المدمج أو المواد المرجعية من الفريزر الذي تبلغ درجة حرارته 80 درجة مئوية تحت الصفر. لكل مجموعة ، ماصة ميكرولتر واحد من الناقل والمواد المرجعية في البئر الأول ، سيكون جزءا من مجموعة واحدة. ماصة الحجم الكامل من البئر الأول إلى البئر التالي.

استمر في سحب الحجم الكامل من بئر إلى آخر حتى يتم دمج جميع الآبار المدرجة في مجموعة واحدة في البئر النهائي. لكل مجموعة ، أضف خمسة ميكرولتر من 50٪ أسيتونيتريل مخفف في ماء بدرجة HPLC لأول بئر أحادي الخلية يتم تضمينه في كل مجموعة. ماصة الحجم الكامل من البئر الأول إلى البئر التالي.

استمر في سحب الحجم الكامل من خلية إلى أخرى ، حتى يتم دمج جميع الآبار المضمنة في مجموعة واحدة في البئر النهائي. الآن قم بنقل كل مجموعة إلى إدخالات زجاجية لأخذ العينات الأوتوماتيكية. جفف العينات بمجرد دمج جميع المجموعات ووضعها في إدخالات زجاجية.

قبل تحليل LC-MS-MS ، أضف 1.2 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ إلى كل مجموعة لإعادة تعليق الببتيدات الملصقة. ضع إدخالات أخذ العينات الأوتوماتيكية في قوارير زجاجية لأخذ العينات الأوتوماتيكية، وأغلق كل عينة بغطاء. دوامة كل قارورة لمدة خمس ثوان للتأكد من اكتمال إعادة التعليق ، ثم تدور لأسفل في قارورة دوارة عند 18 إلى 22 درجة مئوية.

تأكد من أن كل عينة في الجزء السفلي من الملحق بدلا من رشها على الجانبين. ضع القنينات في درج أخذ العينات الأوتوماتيكي ولكل مجموعة ، قم بحقن عينة ميكرولتر واحد لتحليل LC-MS-MS. قد لا يتم فحص كفاءة الهضم ووضع العلامات للخلايا المفردة بشكل مباشر كما هو الحال مع الناقل ، ولكن برنامج DO-MS يوفر مخططات تقدر كفاءة الهضم ووضع العلامات.

يشار إلى سوء الهضم بنسبة عالية من شدة الببتيدات المشقوقة إلى نظيراتها المشقوقة تماما. هناك عامل آخر يجب مراعاته في المجموعات وهو جزء البيانات المفقودة في متوسط كثافة أيون المراسل في كل قناة لوضع علامات على الكتلة الترادفية. عندما يتم إعداد الخلايا المفردة بنجاح ، تكون البيانات المفقودة لكل خلية والتحكم الإيجابي أقل بكثير من عينات التحكم السلبية.

تعد المعالجة الدقيقة للسوائل أثناء تحضير عينة LC-MS-MS أمرا بالغ الأهمية لتحقيق أقصى قدر من استرداد الببتيدات. يمكن تحضير عينات صغيرة من حوالي 100 بيكوجرام إلى 100 نانوجرام لكل بئر لتحليل البروتينات باستخدام حامل متساوي الضغط. يجعل SCoPE2 قياسات البروتينات أحادية الخلية في متناول الباحثين في جميع أنحاء العالم باستخدام الكواشف الشائعة والمعدات المتاحة تجاريا فقط.

إنه قابل للمعالجة اليدوية أو أتمتة الإنتاجية العالية عن طريق معالجة السوائل الآلية.