Name: التنقية البيوكيميائية والتوصيف البروتيني للنوى الليفية الأميلويد من الدماغ (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: اكتشف طريقة تنقية بيوكيميائية فعالة لعزل الليفيات الأميلويدية بدرجة نقاء عالية من أنسجة الدماغ باستخدام الطيف الكتلي. تساعد هذه التقنية الباحثين على تحديد الأهداف العلاجية لمرض ألزهايمر.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01AG061865 إلى R.J.V. و J.N.S. يشكر المؤلفون أعضاء مجموعة أبحاث فاسار وسافاس في جامعة نورث وسترن على مناقشاتهم المدروسة. كما نتقدم بخالص الشكر للدكتور (الدكتورين). أنسجار سايمر ورالف لانغن من جامعة جنوب كاليفورنيا لمدخلاتهما الحاسمة. نشكر الدكتورة فريدة كورابوفا على إعداد العينات والتصوير المجهري الإلكتروني السلبي في مركز جامعة نورث وسترن للفحص المجهري المتقدم.

<ol><li>Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-type+protein+aggregation+and+prion-like+properties+of+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids.</a> Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).</li>
<li>Rambaran, R. N., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils%3A+abnormal+protein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils: abnormal protein assembly.</a> Prion. 2 (3), 112-117 (2008).</li>
<li>Upadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inclusion+bodies+and+defective+proteome+hubs+in+neurodegenerative+disease%3A+New+clues%2C+new+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges.</a> The Neuroscientist. , (2021).</li>
<li>Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+amyloid+fibrils+by+the+use+of+an+antibody+that+recognizes+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils.</a> PLOS ONE. 9 (8), 105433(2014).</li>
<li>Kourelis, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomic+atlas+of+cardiac+amyloid+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+CardioOncology%22%5BJournal%5D)">A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques.</a> JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).</li>
<li>Mangione, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+accuracy+of+proteomic+typing+by+decellularisation+of+amyloid+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies.</a> Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).</li>
<li>Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+brain+A%CE%B2+heterogeneity+through+targeted+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).</li>
<li>Roher, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+toxicity+of+A%CE%B2-%281-42%29+dimer+derived+from+neuritic+and+vascular+amyloid+deposits+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).</li>
<li>Lu, J. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+%CE%B2-amyloid+fibrils+in+Alzheimer%27s+disease+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue.</a> Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).</li>
<li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+studies+of+amyloid+fibril+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).</li>
<li>Meyerhoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics.+Neuromethods%22">Neuroproteomics. Neuromethods</a>. Li, K. 57, Humana Press. Totowa, NJ. (2011).</li>
<li>Hark, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulse-chase+proteomics+of+the+App+knockin+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease+reveals+that+synaptic+dysfunction+originates+in+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals.</a> Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+intercellular+spreading+of+protein+misfolding+mediated+by+viral+ligand-receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 5739(2021).</li>
<li>Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+structure%3A+conformational+diversity+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Amyloid structure: conformational diversity and consequences.</a> Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).</li>
<li>Sundaria, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+%26+imperfect+ageing%3A+Technological+limitations+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574(2021).</li>
<li>Cendrowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+complexity+of+amyloid+polymorphism+using+gold+nanoparticles+and+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).</li>
<li>Seuring, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibril+polymorphism%3A+almost+identical+on+the+atomic+level%2C+mesoscopically+very+different%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).</li>
<li>Close, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+basis+of+amyloid+fibril+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Physical basis of amyloid fibril polymorphism.</a> Nature Communications. 9 (1), 699(2018).</li>
<li>Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+polymorphism%3A+Structural+basis+and+neurobiological+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance.</a> Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).</li>
<li>Konstantoulea, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+Amyloid+%CE%B2+interactions+facilitate+amyloid+assembly+and+modify+amyloid+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure.</a> The EMBO Journal. 41, 108591(2022).</li>
<li>Hondius, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+identifies+new+markers+associated+with+capillary+cerebral+amyloid+angiopathy+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).</li>
<li>Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-interactions+between+the+Alzheimer+disease+amyloid-%CE%B2+peptide+and+other+amyloid+proteins%3A+a+further+aspect+of+the+amyloid+cascade+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).</li>
<li>Hosp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+proteomic+profiling+of+Huntington%27s+disease+inclusions+reveals+widespread+loss+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function.</a> Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).</li>
<li>Wallace, E. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible%2C+specific%2C+active+aggregates+of+endogenous+proteins+assemble+upon+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress.</a> Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).</li>
<li>Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+disordered+proteome+of+human+membrane-less+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles.</a> Proteomics. 18 (5-6), 1700193(2018).</li>
<li>Kepchia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+proteins+aggregate+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain.</a> Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).</li>
<li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li>
<li>Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+understanding+Alzheimer%27s+%CE%B2-amyloid+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li>
<li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li>
<li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+spatial+A%CE%B2+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer%27s+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li>
<li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li>
<li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193(2021).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يعد تطوير فهم واضح لبنية الأميلويد وتكوينه تحديا لعلماء الأحياء الهيكلية وعلماء الكيمياء الحيوية بسبب التعقيدات البيولوجية والقيود التجريبية في استخراج الألياف النقية من أنسجة المخ AD16,17. ألياف الأميلويد متعددة الأشكال على المستوى الجزيئي ، وتظهر مجموعة غير متجانسة من أطوال وتعقيدات متفاوتة18,19. لفهم خصائصها البيولوجية وأهميتها المرضية بشكل أفضل ، يلزم وجود توصيف شامل لتكوين ألياف الأميلويد متعددة الأش...

الأميلويد هو ترتيب فوق جزيئي مستقر للغاية يوجد في مجموعة متنوعة من البروتينات ، بعضها يؤدي إلى تغيرات مرضية1. لوحظ تراكم مجاميع الأميلويد داخل أو خارج الخلايا في العديد من الأمراض العصبية التنكسية2. مجاميع الأميلويد غير متجانسة ويتم إثراؤها بعدد كبير من البروتينات والدهون3. في السنوات الأخيرة ، ولد الاهتمام ببروتينات الأميلويد اهتماما كبيرا بين علماء الأعصاب الأساسيين والانتقاليين. تم تطوير العديد من الطرق لاستخراج وتنقية مجاميع الأميلويد من أنسجة المخ البشرية بعد الوفاة والفئران. التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، والترسيب المناعي ، وإزالة الخلايا ، والعزل الكيميائي الحيوي لمجاميع الأميلويد هي طرق تستخدم على نطاق واسع لاستخراج وتنقية لويحات الأميلويد والألياف والأوليغومرات4،5،6،7. وقد ركزت العديد من هذه الدراسات على تحديد تكوين البروتين لهذه الرواسب الليفية المعبأة بإحكام باستخدام مرض التصلب العصبي المتعدد شبه الكمي. ومع ذلك ، فإن النتائج المتاحة غير متسقة ، والعدد الكبير بشكل مدهش من البروتينات التي تم تنقيتها بشكل سابق والتي تم الإبلاغ عنها سابقا يصعب تفسيرها.
القيد الأساسي للأدبيات الموجودة التي تصف بروتيوم الأميلويد الأساسي في أدمغة نموذج الفئران AD و AD هو أن المادة النقية تحتوي على عدد لا يمكن التحكم فيه من البروتينات المشتركة في التنقية. الهدف العام من هذه الطريقة هو التغلب على هذا القيد وتطوير تنقية كيميائية حيوية قوية لعزل نوى ألياف الأميلويد. تستخدم هذه الاستراتيجية طريقة كيميائية حيوية قائمة على الطرد المركزي لتدرج كثافة السكروز الموصوفة سابقا لعزل أجزاء الأميلويد المخصب غير القابلة للذوبان في SDS من أنسجة المخ البشرية والفئران بعد الوفاة 8,9. تعتمد هذه الطريقة على الأدبيات الموجودة ولكنها تذهب إلى أبعد من ذلك مع الموجات فوق الصوتية وغسل SDS لإزالة معظم البروتينات المرتبطة بالأميلويد المرتبطة بشكل فضفاض ، مما يؤدي إلى عزل ألياف الأميلويد عالية النقاء (الشكل 1). تتغلب الألياف التي تم تنقيتها بواسطة هذا البروتوكول على العديد من التحديات الحالية التي كثيرا ما تواجهها الدراسات الهيكلية للألياف الأميلويد المعزولة من مستخلصات الدماغ. يؤكد تصور هذه الألياف باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) سلامة ونقاء المواد النقية (الشكل 2). في هذه الدراسة ، يتم إذابة الألياف المعزولة وهضمها إلى الببتيدات مع التربسين ، ويمكن لتحليل MS الخالي من الملصقات أن يكشف بسهولة عن هوية البروتينات التي تشكل قلب الليف. والجدير بالذكر أن بعض هذه البروتينات لديها ميل متأصل لتشكيل تجمعات فوق جزيئية في عضيات غير مرتبطة بالغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط العديد من البروتينات المحددة في تحليل ألياف أميلويد بيتا (Aβ) أيضا بأمراض تنكسية عصبية أخرى ، مما يشير إلى أن هذه البروتينات قد تلعب دورا رئيسيا في اعتلالات البروتينات المتعددة.
من غير المرجح أن تغير طريقة SDS / الموجات فوق الصوتية هذه بنية نوى الألياف أو تعطلها. المواد النقية مناسبة أيضا لمجموعة واسعة من نهج التحليل البروتيني من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى واستراتيجيات التحليل الهيكلي الإضافية القائمة على MS ، مثل الربط الكيميائي المتبادل أو تبادل الهيدروجين والديوتيريوم. الاسترداد الكلي باستخدام هذه الطريقة مرتفع نسبيا ، وبالتالي ، فهو مناسب للدراسات الهيكلية التفصيلية ، والتي تتطلب ميكروغرام إلى ملليغرام من المواد النقية. المواد النقية مناسبة أيضا للدراسات الهيكلية باستخدام cryoEM ومجهر القوة الذرية. ويمكن لهذا البروتوكول، بالاقتران مع وضع العلامات النظيرية المستقرة للثدييات، أن يسهل دراسات الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة (NMR) لبنية الأميلويد10.

<table><tbody><tr><td>الإشادة PepMap 100 C18 HPLC العمود 0.075 مم × 20 & nbsp; مم</td><td>Thermo Scientific</td><td>164535</td><td>يمكن استخدام الأدوات البديلة والمواد الكيميائية والأجسام المضادة من الشركات المصنعة الأخرى</td></tr><tr><td>بيكربونات الأمونيوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>بيتا المضادة للأميلويد (1-16) 6E10 الجسم المضاد</td><td>Biolegend</td><td>803001</td><td></td></tr><tr><td>المضاد للأميلويد بيتا (17-24) 4G8 الجسم المضاد</td><td>Biolegend</td><td>800701</td><td></td></tr><tr><td>بيتا المضاد للأميلويد (N terminus 82E1) الجسم المضاد</td><td>IBL America</td><td>10323</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة للألياف النشوانية LOC</td> <td>&nbsp; مجموعة EMD Millipore</td><td>AB2287</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Pico Plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>& nbsp ؛ C1016</td><td></td></tr><tr><td>كولاجيناز</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>كامل&nbsp; كوكتيل مثبط البروتياز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>HyperSep C18 خراطيش</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60108-302</td><td></td></tr><tr><td>خط أنابيب البروتينات المتكاملة - IP2&nbsp;</td><td>http://www.integratedproteomics.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>يودوأسيتاميد (IAA)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>K54 نظام تجانس الأنسجة المحرك</td><td>كول بارمر</td><td>Glas-Col 099C</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>https://www.maxquant.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Micro BCA kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nanoviper 75 & mu ؛ م × 50 &nbsp ؛ سم</td><td>164942</td><td></td><td>الحراري العلمي</td></tr><tr><td>Optima L-90K جهاز طرد مركزي</td><td>فائق بيكمان كولتر</td><td>BR-8101P-E</td><td></td></tr><tr><td>أوربيتراب فيوجن Tribridمقياس طيف الكتلة</td><td>الحراري العلمي</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td></td></tr><tr><td>بيرس C18 أعمدة</td><td>تدور ثيرمو فيشر العلمي</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 مالطيف الأنسجة</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>ProteaseMAX (TM) محسن التربسين الخافض للتوتر</td> السطحي <td>Promega</td><td>V2072</td><td></td></tr><tr><td>محول الخام</td><td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R أجهزة الطرد المركزي</td><td>الدقيقة الحرارية فيشر العلمية</td><td>75002446</td><td></td></tr><tr><td>سرعة فراغ مكثف</td><td>Labconco</td><td>7315021</td><td></td></tr><tr><td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Gold-Mass المواصفات الصف</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano نظام</td><td>حراري علمي</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr></tbody></table>

التنقية البيوكيميائية والتوصيف البروتيني للنوى الليفية الأميلويد من الدماغ

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

شوائب الألياف البروتينية هي السمات المميزة المرضية الرئيسية للأمراض العصبية التنكسية المتعددة. في المراحل المبكرة من مرض الزهايمر (AD) ، تشكل ببتيدات أميلويد بيتا بدائيات في الفضاء خارج الخلية ، والتي تعمل كبذور تنمو تدريجيا وتنضج إلى لويحات أميلويد كبيرة. على الرغم من هذا الفهم الأساسي ، فإن المعرفة الحالية ببنية ألياف الأميلويد وتكوينها وأنماط ترسبها في الدماغ محدودة. كان أحد الحواجز الرئيسية هو عدم القدرة على عزل ألياف الأميلويد عالية النقاء من مستخلصات الدماغ. وقد استخدمت في السابق أساليب تنقية التقارب والتقاط التشريح المجهري بالليزر لعزل الأميلويد ولكنها محدودة بسبب الكمية الصغيرة من المواد التي يمكن استردادها. يصف هذا البروتوكول الجديد القوي التنقية الكيميائية الحيوية لنوى لوحة الأميلويد باستخدام ذوبان كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) مع الطرد المركزي بتدرج كثافة السكروز والموجات فوق الصوتية وينتج ألياف عالية النقاء من مرضى AD وأنسجة المخ نموذج AD. يمثل التحليل البروتيني القائم على قياس الطيف الكتلي (MS) للمواد النقية من أسفل إلى أعلى استراتيجية قوية لتحديد جميع مكونات البروتين الأولية تقريبا من ألياف الأميلويد. كشفت الدراسات البروتينية السابقة للبروتينات في إكليل الأميلويد عن مجموعة كبيرة بشكل غير متوقع ومتنوعة وظيفيا من البروتينات. والجدير بالذكر أنه بعد تحسين استراتيجية التنقية ، تم تقليل عدد البروتينات المشاركة في التنقية بأكثر من 10 أضعاف ، مما يشير إلى النقاء العالي للمواد غير القابلة للذوبان SDS المعزولة. سمح التلطيخ السلبي والمجهر الإلكتروني المناعي الذهبي بتأكيد نقاء هذه المستحضرات. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم السمات المكانية والبيولوجية التي تسهم في ترسب هذه البروتينات إلى شوائب أميلويد. هذه الاستراتيجية التحليلية مجتمعة في وضع جيد لزيادة فهم بيولوجيا الأميلويد.

هنا ، يتم تلخيص طريقة مفصلة لعزل وتنقية ألياف الأميلويد باستخدام طريقة تنقية الطرد المركزي المعدلة لتدرج كثافة السكروز (انظر الشكل 1). الابتكار في هذه الطريقة هو تضمين خطوات الغسيل القائم على الموجات فوق الصوتية باستخدام نظام صوتنة الحمام المائي متبوعا بذوبان SDS ، والذي يزيل العديد من البروتينات المرتبطة بشكل فضفاض من ألياف الأميلويد التي تشترك في تنقية الألياف عالية الكثافة والنظيفة. تولد خطوة الموجات فوق الصوتية قوة قص عالية وتثير الألياف ، وتخفف من القوى الكارهة للماء وتطلق البروتينات ال...

تسهل طريقة التنقية البيوكيميائية هذه مع التحليل البروتيني القائم على قياس الطيف الكتلي التوصيف القوي لنوى ألياف الأميلويد ، مما قد يسرع من تحديد الأهداف للوقاية من مرض الزهايمر.

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

لويحات الأميلويد مطلوبة لتشخيص مرض الزهايمر. ومع ذلك ، فهي ليست كافية. وعلى الرغم من هذه الحقيقة، فإنها لا تزال غامضة ويرجع ذلك جزئيا إلى التحديات في توصيف محتوياتها.بروتوكولنا فعال للغاية في عزل ألياف الأميلويد بدرجة عالية من النقاء وهو مناسب تماما لفهم التفاصيل الدقيقة للهيكل والتكوين. قد تساعد معرفة محتوى البروتين في لويحات الأميلويد في تحديد أهداف التدخل العلاجي التي قد تؤخر أو تتداخل أو تمنع تراكمها. لذلك ، تأخير بداية المرض.هذه الطريقة مناسبة تماما لاستخراج رواسب البروتين من أنسجة المخ المتدهورة ومجاميع البروتين في مسارات البروتين الأخرى المختلفة. ابدأ بوضع منطقة أنسجة المخ المجمدة الطازجة أو المجمدة في أنبوب من ملليلتر يحتوي على ستة إلى ثمانية حبات من السيراميك في مخزن مؤقت للتجانس البارد المعد حديثا. ثم قم بطحن الأنسجة باستخدام مجانس مطحنة الخرز عند 4000 دورة في الدقيقة مع دورتين من 30 ثانية على وخارج النبض.الآن أضف تسعة ملليلترات من المخزن المؤقت للتجانس البارد على الجليد إلى ملليلتر واحد من تجانس أنسجة المخ وأنبوب 15 ملليلتر وختمه بشرائط فيلم الشمع المختبري. لضمان قابلية ذوبان قوية، حافظ على دوران الأنبوب طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، أضف السكروز الصلب إلى تعليق مستخلص الأنسجة إلى تركيز نهائي من 1.2 مول.خلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي كان 250،000 × غرام لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من السوبرناتانت ، أعد تعليق الكريات في ملليلتر من المخزن المؤقت للتجانس الذي يحتوي على 1.9 سكروز مولي عن طريق التثليث وأجهزة الطرد المركزي عند 125،000 × g لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل الطبقة الصلبة البيضاء العلوية إلى أنبوب جديد وقم بإذابة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل البارد بالثلج عن طريق الملاعبة لأعلى ولأسفل عدة مرات.نظرا لأن الكريات غنية أيضا بألياف الأميلويد ، تخلص من الطبقة الوسطى المائية وادمج الكريات مع الطبقة العليا للحصول على عائد أعلى. الطرد المركزي للكسور مجتمعة عند 8،000 × غرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من السوبرناتانت ، أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من عازل الهضم البارد للثلج واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على دوامة.قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى ، ثم اغسل الكريات مرتين في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت Tris البارد بالجليد وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للذوبان عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وبسرعة الطرد المركزي للأنبوب عند 200،000 × g لمدة 60 دقيقة عند أربع درجات مئوية. احفظ الكريات ، ثم قلل تركيز السكروز من 1.3 إلى مول واحد عن طريق إضافة 50 ملليمولار تريس المخزن المؤقت إلى السوبرناتانت.قم بطرد مركزي للجهاز الخارق مرة أخرى ، ثم قم بإذابة كل من الكريات و 100 ميكرولتر من مخزن Tris العازل الذي يحتوي على 0.5٪ SDS. لتنقية الأميلويد ، قم بإذابة الكريات الغنية بالأميلويد باستخدام الموجات فوق الصوتية في جهاز صوتنة الحمام لمدة 20 دورة ، ثم قم على الفور بالطرد المركزي للمادة عند 20،000 × g لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من 0.5٪ SDS Tris العازلة وكرر الغسيل أربع مرات أخرى ، بعد خطوة الطرد المركزي النهائية ، اغسل الكريات في 200 ميكرولتر من الماء فائق النقاء وأجهزة الطرد المركزي 20،000 × جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة أي منظف متبقي.قم بإذابة الكريات النهائية التي تحتوي على ألياف أميلويد نقية في 100 ميكرولتر من الماء فائق النقاء. قم بإذابة 100 ميكرولتر من ألياف الأميلويد النقية في 400 ميكرولتر من الميثانول والدوامة جيدا. ثم امزج 100 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة مرة أخرى.بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من الماء فائق النقاء والدوامة جيدا. بعد الطرد المركزي عند 12،000 × g لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة الطبقة المائية العليا بعناية دون إزعاج طبقة الواجهة التي تحتوي على رقائق البروتين وإضافة نفس الحجم من الميثانول مرة أخرى. كرر الطرد المركزي ، وتخلص من supernatant وتجفيف الكريات في الهواء.للهضم ، قم بإذابة الكريات في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهيدروكلوريد جوانيدين وسونيكات في حمام ماء بارد مثلج. ثم دوامة تماما لمدة 45 دقيقة إلى ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، إضافة 50 ميكرولتر من محلول الفاعل بالسطح 0.2 ٪ والدوامة مرة أخرى لمدة 60 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من 500 ملليمولار TCEP واحتضنه لمدة 60 دقيقة.ثم أضف ميكرولترين من يودواسيتاميد 500 ملليمول واحتضنه في الظلام لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإخماد يودواسيتاميد بخمسة ميكرولترات من محلول TCEP لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، أضف الحجم المطلوب من محلول بيكربونات الأمونيوم 50 ملليمولار إلى الأنبوب لتقليل تركيز الجوانيدين إلى 1.5 مول.أيضا ، إضافة محلول 1 ٪ السطحي إلى الأنبوب. ثم أضف التربسين واترك الأنبوب يختلط عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، أضف حمض الفورميك إلى محلول الببتيد المهضوم لخفض الرقم الهيدروجيني إلى 2.0 ، ثم قم بتنشيط عمود الدوران C18 بإضافة 200 ميكرولتر من محلول الميثانول بنسبة 50٪ والدوران عند 1500 × g لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك ، قم بموازنة أسرة راتنج عمود C18 عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوازن والدوران مرة أخرى لمدة دقيقتين. بعد التوازن ، قم بتحميل محلول الببتيد المحمض على عمود C18 وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × g لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. أعد تحميل التدفق من خلاله، وقم بتدوير العمود، وتخلص من التدفق الثاني من خلاله.ثم اغسل الببتيدات المرتبطة براتنج C18 مرتين باستخدام المخزن المؤقت للغسيل. قم بالتخلص من الببتيد ثلاث مرات عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإزالة والطرد المركزي للعمود. جفف الببتيدات في مكثف فراغ السرعة عن طريق تبخير المحلول المائي.يمكن حفظ الكريات الجافة عند 20 درجة مئوية لبضعة أسابيع قبل تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. يوثق تلطيخ الكونغو الأحمر للأميلويد النقي إثراء ألياف الأميلويد مقارنة بالكسر القابل للذوبان في SDS. لم يظهر الجزء القابل للذوبان SDS وجود الأميلويدات.أكد هيكل الألياف النقية وجود ألياف أميلويد نقية تقريبا. أيضا ، أكدت العلامات المناعية وجود ببتيدات أميلويد بيتا 42. أظهر التلطيخ باستخدام الأجسام المضادة المضادة للأميلويد بيتا 42 والأجسام المضادة للألياف وفرة نسبية من ببتيدات بيتا 42 أميلويد في الألياف.أظهرت كسور الأميلويد النقية وجود ما يقرب من 250 بروتينا ، في حين أن الجزء الذي تم جمعه قبل غسل الموجات فوق الصوتية و SDS يحتوي على أكثر من 2،500 بروتين. أظهرت النوى الليفية إثراء البروتينات المرتبطة بالعضيات غير المرتبطة بالغشاء والمجمعات فوق الجزيئية. الأميلويد هي أنواع منخفضة الوفرة ، ربما بضعة بيكوغرام إلى بضعة ميكروغرام لكل ملليغرام من أنسجة المخ.لذلك عليك أن تكون حذرا للغاية أثناء التقاط الطبقات أو المنصات أو التخلص من السوبرناتانت. مع تطوير هذه التقنية ، يمكنك الآن تحديد البروتينات المرتبطة ببذور الأميلويد الأولية بثقة أكبر ، وتوصيف هيكلها واستهدافها للتدخل العلاجي. لذلك ، منع ظهور هذا المرض القاتل.

biochemical-purification-proteomic-characterization-amyloid-fibril

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

وصفنا تقنية لإعداد الخليط أوضح القشرية الإنسان ، وفصل البروتين SDS - PAGE ، واسترجاع مستضد immunoblotting مع الضد إلى الببتيد Aβ. باستخدام هذا البروتوكول ، ونحن باستمرار اكتشاف Aβ موحودي multimeric في الأنسجة والقشرية من البشر مع أمراض الزهايمر.

SDS-PAGE/Immunoblot الكشف عن Multimers Aβ في الأنسجة البشرية القشرية الخليط باستخدام مستضد استرجاع حاتمة

ووصف طريقة لتنقية واسعة النطاق للمجال APP داخل الخلايا (AICD). وصفنا أيضا منهجية...

تنقية وتجميع على البروتين اميلويد السلائف المجال بين الخلايا

يوضح هذا الفيديو بروتوكول عزل ألياف الأميلويد من مستخلص أنسجة دماغ الفئران باستخدام الكثافة والتدرج المركزي وهضم البروتينات غير النشوانية.

عزل ألياف الأميلويد من مستخلص أنسجة المخ

بروتوكول استخراج البروتين الشائعة باستخدام العازلة اليوريا / ثيوريا / SDS لأنسجة المخ الفئران والإنسان يسمح يفهم المرء من البروتينات عن طريق 2D-DIGE وتوصيف لاحقا من قبل 2DE صغيرة immunoblotting. هذه الطريقة تمكن واحد للحصول على نتائج أكثر استنساخه وموثوق بها من الخزعات الإنسان ونماذج تجريبية.

بروتين إجماع الدماغ المستمدة، بروتوكول استخراج لدراسة الإنسان والفئران بروتيوم الدماغ عن طريق كل من 2D-DIGE والبسيطة 2DE Immunoblotting

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل ألفا سينوكلين (α-syn) غير القابل للذوبان / المجمعة بشكل متزايد من أنسجة المخ البشري بعد الوفاة. من خلال استخدام المخازن المؤقتة ذات قوة المنظفات المتزايدة وتقنيات الطرد المركزي الفائق عالية السرعة ، يمكن فحص الخصائص المتغيرة لتجميع α-syn في الأنسجة المريضة وغير المريضة.

استخراج متتابعة من القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان ألفا Synuclein من أدمغة الشلل الارتعاشي

&lt; p class = "jove_content" &gt;هنا نبلغ عن بروتوكول تنقية HPLC مخصص ينتج عنه ببتيدات أميلويد بيتا 42 (Aβ42) عالية النقاء وأميلويد بيتا 40 (Aβ40) ، قادرة على تكوين القلة. بيتا الأميلويد هو ببتيد شديد التراكم وكاره للماء متورط في مرض الزهايمر. تجعل الطبيعة النشوانية للببتيد تنقيتها تحديا.

بروتوكول تنقية مصممة HPLC أن ينتج عالية النقاء اميلويد بيتا اميلويد بيتا 42 و 40 الببتيدات، قادرة على قليل وحدات تشكيل

ويرد وصف بروتوكولا تجزئة مختصر لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة.

إثراء مجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة

يسمح التصوير الجزيئي مع الليزر ساعد مصفوفة على الامتزاز/التأين التصوير الطيف الكتلي (استخدام نظام الرصد الدولي) تعيين تحليلها متعددة متزامنة في العينات البيولوجية. نقدم هنا، بروتوكولا للكشف والتصور لبروتين بيتا اميلويد في أنسجة الدماغ من مرض الزهايمر وعينات أنجيوباثي اميلويد الدماغي استخدام استخدام نظام الرصد الدولي.

التصور لرواسب بيتا اميلويد في الدماغ البشري مع الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين التصوير الكتلي

المقدمة هنا هي اثنين من الأساليب التي يمكن استخدامها منفردة أو مجتمعة لتحليل أثر بيتا-اميلويد على هيكل فيبرينوجين جلطة. وشملت بروتوكول لإنشاء في المختبر فيبرينوجين جلطة، تليها التعكر تجلط والمجهر الإلكتروني المسح أساليب.

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

المقدمة هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين الشكل الأصلي ، بريفيبريلار ، والخلايا الليفية اميلويد ناضجه من الببتيدات مختلفه والبروتينات مع الميتوكوندريا معزولة من الانسجه المختلفة ومناطق مختلفه من الدماغ.

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

توضح هذه الدراسة طرقا تجريبية لتوصيف GFAP وطفراته المسببة للأمراض كيميائيا، مع التركيز على تجميع الخيوط، والتجميع، والتعديل بعد الترجمة. تم تحليل بروتينات GFAP عالية النقاء، مما كشف عن رؤى حول آليات مرض ألكسندر قد توفر إطارا لدراسة الأهداف العلاجية المحتملة وفهم طفرات GFAP والاضطرابات المرتبطة بها.

الأساليب التجريبية للتحليل الكيميائي الحيوي للبروتين الحمضي الليفي الدبقي ومتغيرات المرض المرتبطة به

اكتشف طريقة تنقية بيوكيميائية فعالة لعزل الليفيات الأميلويدية بدرجة نقاء عالية من أنسجة الدماغ باستخدام الطيف الكتلي. تساعد هذه التقنية الباحثين على تحديد الأهداف العلاجية لمرض ألزهايمر.

التنقية البيوكيميائية والتوصيف البروتيني للنوى الليفية الأميلويد من الدماغ

استكشف المزيد من الفيديوهات