تصنيع اللوحات الوعائية الهندسية باستخدام تقنيات الطباعة 3D
مايو 19, 2022
تتطلب اللوحات الهندسية شبكة وعائية وظيفية مدمجة. في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة لتصنيع رفرف الأنسجة المطبوعة 3D التي تحتوي على شبكة الأوعية الدموية الهرمية ومفاغرتها الجراحية المجهرية المباشرة إلى الشريان الفخذي للفئران.
يسمح بروتوكولنا للباحثين بإنشاء شبكات أوعية هرمية داخل رفرف مصمم بالكامل وقابل للزرع ، مما مهد الطريق لإجراء دراسات جديدة حول سلوك الأوعية الدموية تحت التكامل في الجسم الحي. جمعت هذه التقنية بين براعة تقنيتين للطباعة 3D لإنشاء وتجميع الأوعية على الميكرو والميزوسكال التي يمكن مفاغرتها مباشرة مع الأوعية المضيفة باستخدام الجراحة المجهرية. يمكن استخدام اللوحات الوعائية المصممة بالكامل لعلاج عيوب الأنسجة الكبيرة وكذلك لتوفير منصة لدراسة تطورات الأنسجة وتكاملها.
يمكن توسيع الطرق المقترحة لدراسة دمج الخلايا الخاصة بالأنسجة ، وكذلك لتقييم استخدام الحبر الحيوي والمواد الداعمة المختلفة. ابدأ بملء قالب BVOH ب 30 ميكرولتر من محلول البوليمر. قم بالطرد المركزي للقالب عند 100 مرة جم لمدة دقيقتين وقم بتعبئة القالب ب 20 ميكرولتر أخرى من محلول البوليمر لضمان الملء الكامل.
قم بتجميد القوالب المملوءة عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة على الأقل لضمان تجميد جميع محلول البوليمر. قم بإزالة المذيب من القوالب عن طريق تجميدها بين عشية وضحاها. لإزالة مادة قالب الأضحية ، انقل القوالب بعد عملية التجفيف بالتجميد إلى حمام مائي منزوع الأيونات سعة 5 لترات تحت تحريك لطيف.
استبدل الماء في الحمام عندما يصبح غائما. عندما يذوب كل BVOH ، جفف السقالات في الهواء وتخزينها في غرفة فراغ حتى الاستخدام. انقل ما يقرب من 4 ملليلترات من مواد الدعم المضغوطة المعدة إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا باستخدام ماصة إزاحة إيجابية.
اضغط على صفيحة البئر على سطح صلب لإجبار مادة الدعم على الانتشار بالتساوي في البئر. قم بإعداد تعليق يحتوي على 2 مليون HAMEC-ZsGreen و 6 ملايين خلية جذعية لب الأسنان في 10 ملليلتر من وسط الخلايا البطانية. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 مرة جم لمدة 4 دقائق للحصول على بيليه خلوي ، ثم قم بشفط الوسط الفائق وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 ملليلتر من الحبر الحيوي rhCollMA للحصول على حبر حيوي بتركيز إجمالي للخلية يبلغ 8 ملايين خلية لكل 1 ملليلتر من الحبر الحيوي.
قم بتركيب إبرة قطرها الداخلي 0.22 ملم في خرطوشة طباعة كهرمانية سعة 3 ملليلتر وضع الخرطوشة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. انقل 1 ملليلتر من خليط الخلايا والحبر الحيوي إلى خرطوشة الطباعة عن طريق ملئها من الأعلى باستخدام ماصة إزاحة إيجابية لتقليل الفقاعات. قم بتركيب خرطوشة الطباعة في الأداة المناسبة في الطابعة الحيوية.
ارسم نمطا ثنائي الأبعاد لمربع 4 ملليمتر يحتوي على قناة دائرية قطرها 2 ملم في وسطها. بثق الرسم بمقدار 4 ملليمترات للحصول على مكعب 4 ملم مع قناة مركزية. تصدير هذا الكائن كملف STL.
قم باستيراد قالب STL بلوحة 12 بئرا إلى علامة تبويب النمذجة الصلبة في برنامج تقطيع الطابعة الحيوية وضعه في المنطقة المخصصة من سرير الطباعة الافتراضي. قم باستيراد ملف STL الخاص بالشكل المكعب إلى علامة تبويب النمذجة الصلبة في برنامج تقطيع الطابعة الحيوية. انقر فوق خانة الاختيار استخدام مقسم طريقة العرض الخارجية متبوعا بتكوين مقسم طريقة العرض ضمن قسم خاصية الكائن.
في النافذة المنبثقة، اختر نمطا مستقيما لنمط التعبئة واكتب 30٪ في كثافة التعبئة، انقر فوق قبول. انقر على المكعب وحركه باستخدام الماوس لوضع نسخة من شكل المكعب في كل بئر افتراضي مطلوب. انقر فوق الزر "إضافة مادة" في علامة التبويب "المواد" في برنامج تقطيع الطابعة الحيوية لإنشاء إعدادات مواد جديدة للحبر الحيوي rhCollMA.
اختر إعدادات المواد للطباعة. للضغط ، اكتب 2 رطل لكل بوصة مربعة ، وللسرعة اكتب 20 ملم في الثانية في المربعات المقابلة. قم بتعيين قيم عرض الخط وارتفاع الخط إلى 0.24 ملم، وقيمة التسارع إلى 400 ملم لكل ثانية مربعة.
في علامة التبويب النمذجة الصلبة ، انقر فوق كائن المكعب ثم انقر فوق مادة rhCollMA من قسم المواد لتعيينها إلى شكل المكعب. في علامة التبويب التجميع الحيوي ، انقر فوق الزر إرسال مهمة الطباعة لإرسال مهمة الطباعة إلى الطابعة الحيوية. قم بتحميل خرطوشة الطباعة المحملة بالحبر الحيوي الخلوي في أداة التوزيع الهوائية المحيطة سعة 3 ملليلتر الخاصة بالطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد القائمة على البثق.
انقر فوق الزر تبريد أسفل علامة التبويب التحكم في التدفئة أو التبريد على شاشة واجهة الطابعة الحيوية لضبط درجة حرارة سرير الطباعة على 4 درجات مئوية. قم بتحميل اللوحة بحمام الدعم الموجود على سرير الطابعة. في علامة التبويب طباعة على شاشة واجهة الطابعة الحيوية ، انقر فوق مهمة الطباعة ، ثم انقر فوق ابدأ ، متبوعا ب GO لبدء مهمة الطباعة.
بعد الطباعة ، قم بتعريض لوحة البئر لمصدر ضوء 405 نانومتر بكثافة 3 مللي واط لكل سنتيمتر مربع لمدة 30 ثانية لبدء الربط المتقاطع للحبر الحيوي rhCollMA. بعد الربط المتبادل ، احتضن صفيحة البئر عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة على الأقل حتى يذوب كل حمام الدعم. استنشق حمام الدعم المسال بلطف واستبدله بوسط الخلايا البطانية.
احتضان التركيبات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. مباشرة بعد إزالة مواد الدعم من شبكة الأوعية الدموية الدقيقة المطبوعة بيولوجيا ، ضع سقالة الأوعية الدموية PLLA:PLGA المغلفة بالفيبرونيكتين بجوار الهيكل المطبوع بيولوجيا. أدخل السقالة الوعائية في القناة الرئيسية للهيكل المطبوع بيولوجيا.
احتضان الهياكل المجمعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين. قم بإعداد تعليق خلوي للخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية المعبرة عن الطماطم بتركيز 10 ملايين خلية لكل ملليلتر. ضع قطرة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية هذا على سطح مسعور.
ضع السقالات الوعائية بلطف فوق القطرة بحيث يتلامس تجويف السقالة على أحد طرفيها مع قطرة الخلية. استنشاق القطرة من الطرف المقابل للسقالة التي تملأ تجويفها بتعليق الخلية. ضع السقالة الجالسة في أنبوب طرد مركزي صغير وضعها في دوار داخل حاضنة مرطبة لمدة 60 دقيقة.
أخيرا ، انقل السقالة إلى صفيحة من 12 بئرا وأضف 2 ملليلتر من وسط الخلايا البطانية. يظهر هنا المنظر الجانبي لرفرف تمثيلي مصمم هندسيا تم تصويره بعد أربعة أيام من البطانة البطانية للسقالة الوعائية. تظهر الأوعية الدموية الدقيقة المطبوعة بيولوجيا باللون الأخضر ، بينما تظهر البطانة البطانية باللون الأحمر.
تظهر الصورة التمثيلية المفاغرة بين الأوعية الدموية المطبوعة بيولوجيا والبطانة البطانية. يظهر هنا التلطيخ المناعي للأكتين العضلي الأملس والنوى والخلايا البطانية بعد سبعة أيام من الحضانة. تعرض الصورة التمثيلية مفاغرة مكتملة للرفرف الهندسي مع الشريان الفخذي للفئران قبل إزالة المشبك وبعد إزالة المشبك.
يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة نضج وتكامل الأوعية الدموية المطبوعة 3D في الجسم الحي ومراقبة تروية الزرع في الطرف الخلفي لتحديد إمكانات وسلامة استخدامه لعلاج عيوب الأنسجة.
الموجز
يحدد هذا البروتوكول طريقة لإنشاء غضروف نسيجي مطبوع ثلاثي الأبعاد مع شبكة وعائية هرمية، مما يتيح وصلاً جراحيًا مباشرًا لشريان الفخذ للفئران. يجمع هذا الأسلوب بين تقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد المتقدمة لتسهيل دراسة سلوك الأوعية الدموية أثناء الدمج في الجسم الحي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الهندسة النسيجية
- بيولوجيا الأوعية الدموية
- الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد
الخلفية
- تتطلب الغضاريف المهندسة شبكات وعائية وظيفية للدمج الناجح.
- تفتقر الطرق الحالية إلى تقنيات فعالة لإنشاء هياكل نسيجية مربوطة بالأوعية الدموية.
- تهدف هذه الدراسة إلى معالجة هذه القيود من خلال طرق الطباعة ثلاثية الأبعاد المبتكرة.
- فهم سلوك الأوعية الدموية أمر بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات هندسة الأنسجة الفعالة.
هدف الدراسة
- لتصنيع غضروف نسيجي مطبوع ثلاثي الأبعاد مع شبكة وعائية هرمية.
- لتمكين الوصل المباشر مع الأوعية الدموية المضيفة.
- لتوفير منصة لدراسة تطور الأنسجة ودمجها.
الطرق المستخدمة
- مزيج من تقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد المجهرية والمتوسطة المقياس.
- إعداد محاليل البوليمرات وتعليقات الخلايا للطباعة الحيوية.
- استخدام التجفيف بالتبريد وإزالة المذيبات لإنشاء السقالات.
- تقنيات جراحية مجهرية لوصل الغضاريف المهندسة بالأوعية الدموية المضيفة.
النتائج الرئيسية
- تصنيع ناجح للغضاريف النسيجية المربوطة بالأوعية الدموية مع شبكات هرمية.
- ثبتت جدوى الوصل المباشر لشريان الفخذ للفئران.
- قدمت رؤى حول سلوك الأوعية الدموية أثناء الدمج في الجسم الحي.
- أرست أساسًا للدراسات المستقبلية حول دمج الخلايا المحددة للأنسجة.
الاستنتاجات
- تعزز الطريقة المطورة من إمكانية علاج العيوب النسيجية الكبيرة.
- تفتح فرصًا لأبحاث إضافية حول الهياكل النسيجية المربوطة بالأوعية الدموية.
- يمكن تكييف هذا الأسلوب لتقييم مختلف المواد الحيوية ومواد الدعم.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Engineering hierarchical vascular networks using 3D bioprinting addresses a critical bottleneck in creating functional, implantable tissues for regenerative medicine and reconstructive applications. This approach enables the fabrication of complex, perfusable tissue constructs that can be directly integrated with host vasculature, supporting translational research and preclinical model development. The method enhances predictive confidence in tissue integration and vascularization, informing risk-adjusted portfolio decisions in advanced tissue engineering pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of vascular integration and tissue perfusion in engineered constructs.
- Supports biological de-risking by modeling vessel anastomosis and network maturation.
- Facilitates predictive assessment of tissue viability and integration potential.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible vascularized tissue platforms for compound evaluation.
- Enables quantitative assessment of endothelial and support cell behavior in 3D environments.
- Supports scalability and platform reuse for diverse bioink and cell type screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered tissue models with disease-relevant vascularization and integration endpoints.
- Enables continuity from in vitro tissue development to in vivo implantation and perfusion studies.
- Supports risk-adjusted advancement of tissue constructs for reconstructive and regenerative applications.
Pipeline & Workflow Integration
This combined 3D bioprinting and sacrificial mold approach integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling iterative optimization of vascularized tissue constructs for downstream translational studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vessel formation, anastomosis, and tissue integration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs on vascular network assembly and cell viability.
- Analytics: Provides imaging and immunostaining readouts for network connectivity and maturation.
- Translational Research: Bridges in vitro tissue engineering with in vivo perfusion and integration models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various tissue types and vascularization studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tissue integration and vascular function.
- Operational Value: Standardizes fabrication and assessment of vascularized constructs for reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for tissue engineering programs targeting clinical translation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue constructs for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D bioprinting, cell culture, and microsurgical techniques.
- Demands access to extrusion-based bioprinters, imaging, and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of bioink formulations and scaffold fabrication.
- Adaptable to different cell types and support materials for diverse tissue models.
- Limited by the need for precise control of vascular network architecture and integration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:04
Vascular Scaffold Fabrication
1:54
Granular Support Bath Preparation and Incorporation of Endothelial Cells and Support Cells with the Bioink
3:09
Bioprinting Microvascular Networks Using rhCollMA Bioink
6:00
Assembling the Bioprinted Microvascular Network with the Vascular Scaffold to Obtain the Engineered Vascularized Flap
7:12
Results: Representative Images of the Assembled Vascularized Flap
7:59
Conclusion
