عزل وتحديد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية المنقولة بالماء والتوصيف الجزيئي لجيناتها المقاومة للمضادات الحيوية

تجيب طريقتنا على الأسئلة الرئيسية ، مثل ما هو الحمل الكلي للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية في عينة الماء؟ ما هي هوية هذه البكتيريا وما هي الأنواع المختلفة من السمات والجينات المقاومة للمضادات الحيوية التي تحملها؟ ميزة بروتوكولنا هي أنه يمكنه اكتشاف حتى البكتيريا التي لا يمكن زراعتها في المختبر ، والتي تشكل نسبة كبيرة من إجمالي البكتيريا في عينة المياه.

وبالتالي ، من الناحية النظرية ، لا يتم استبعاد أي بكتيريا أو سماتها المقاومة. يمكن تكرار هذه التقنية التوافقية التي تتضمن تقنيات قائمة على الثقافة ومستقلة عن الثقافة وتخصيصها لأي عينة تم الحصول عليها من مياه الصرف الصحي ، والنفايات السائلة الصيدلانية أو المستشفيات ، والإعدادات السريرية وغير السريرية ، وأكثر من ذلك. جنبا إلى جنب مع ديفيكا ، فإن إظهار الإجراءات التجريبية سيكون هارشالي شيندي ومايتري ميشرا ، وكلاهما من كبار زملاء الأبحاث من مختبري.

للبدء ، قم بمعالجة عينة الماء بشكل معقم عن طريق ترشيحها من خلال قطعة قماش شاش معقمة لإزالة أي جسيمات. ثم ، قم بتخفيف عينة المياه المفلترة بشكل متسلسل لمزيد من التحليل. لتحديد الحمل البكتيري الكلي ، ضع 100 ميكرولتر من التخفيفات المناسبة لعينة المياه المفلترة على ألواح أجار R2A الصلبة والتكرارات ، وانتشر بالتساوي.

احتضان جميع لوحات انتشار العينة عند 35 إلى 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد فترة الحضانة ، عد المستعمرات وعبر عن الحمل البكتيري الكلي في وحدات تشكيل المستعمرة لكل ملليلتر. لتحديد عدد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية ، أضف المضادات الحيوية بشكل منفصل إلى أنابيب تحتوي على 20 ملليلتر من أجار R2A المنصهر المعقم المعدل عند 40 درجة مئوية تقريبا.

حرك المزيج بالتساوي واسكبه على أطباق بتري معقمة قبل أن يتجمد الآجار. لمراقبة الجودة وللتحقق من فعالية المضادات الحيوية ، انشر 100 ميكرولتر من المعلق البكتيري على المضادات الحيوية الخاصة بها التي تحتوي على ألواح أجار معدلة R2A. احتضان الألواح عند 35 إلى 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ، ثم حدد عدد البكتيريا.

لتحضير قالب الحمض النووي من العزلات ل PCR ، باستخدام عود أسنان معقم ، خذ مستعمرة نقية معزولة واحدة من العزلة تنمو على صفيحة بتري. المستعمرة البكتيرية في 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم في أنبوب طرد مركزي صغير وغليها في حمام مائي مغلي أو حمام جاف لمدة 10 دقائق عند 100 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي معلق عند 10،000 جم لمدة دقيقتين لتكوير الحطام ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم جديد لاستخدامه كقالب الحمض النووي الخام.

لتضخيم منطقة V3 من جين 16S rRNA بواسطة PCR ، قم بإعداد 40 ميكرولتر من خليط التفاعل في أنبوب PCR. ضع الأنبوب في الكتلة الحرارية ، وقم بتشغيل البرنامج المناسب في جهاز التدوير الحراري PCR. لحل وتصور مضخمات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، امزج 10 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المضخم في ميكرولترين من المخزن المؤقت لتحميل الهلام 6x ، وقم بتحميل هذا الخليط في آبار هلام الأغاروز بنسبة 1.5٪ جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي المزدوج المكون من 100 قاعدة لتقدير حجم الأمبليكونات.

قم بإجراء رحلان كهربائي للهلام في المخزن المؤقت لخزان TAE عند 80 إلى 100 فولت حتى تعمل صبغة التتبع 3/4 من الجل. ثم تصور نطاقات amplicon تحت transilluminator الأشعة فوق البنفسجية. لتحضير اللقاح ، قم بتلقيح مستعمرة مقاومة واحدة معزولة للمضادات الحيوية باستخدام حلقة معقمة في ملليلتر من مرق لوريا بيرتاني ، أو LB ، بدون أي مضاد حيوي واحتضانها عند 37 درجة مئوية عند 80 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، أضف 100 إلى 150 ميكرولتر من الثقافة المزروعة طوال الليل إلى ملليلتر من مرق LB الطازج غير الانتقائي واحتضانها لمدة ساعتين إلى أربع ساعات حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 0.4 إلى 0.5. قم بتخفيف معلق المزرعة المزروعة حديثا باستخدام محلول ملحي معقم بنسبة 0.85٪ واخلطه برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي للوصول إلى كثافة زراعة تعادل معيار 0.5 McFarland. في غضون 15 دقيقة من التخفيف ، اغمس قطعة قطن معقمة في اللقاح وقم بإزالة التعليق الزائد لتجنب الإفراط في تلقيح الألواح.

ثم انشر الثقافة بالتساوي على لوحة أجار مولر هينتون المعدة ، بدءا من الأعلى وذهابا وإيابا من الحافة إلى الحافة. ثم قم بتدوير اللوحة بمقدار 60 درجة ، وابدأ في المسح مرة أخرى. لوضع أقراص المضادات الحيوية ، استخدم ملقط معقم باللهب وانقل أقراص المضادات الحيوية بشكل معقم إلى ألواح الآجار الملقحة.

اضغط على الأقراص برفق لضمان مستوى كامل من الاتصال مع أجار. ضع العدد المناسب من أقراص المضادات الحيوية على صفيحة أجار من خلال النظر في الكائن الحي المضاد الحيوي المستخدم وحجم اللوحة لتجنب تداخل مناطق التثبيط. في غضون 15 دقيقة من تطبيق قرص المضادات الحيوية ، اقلب الألواح واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، قم بقياس منطقة قطر التثبيط بالمليمترات وتفسيرها وفقا لقيم نقطة التوقف التي قدمتها EUCAST. تم العثور على الحمل البكتيري الكلي في عينة الماء ليكون 3.0 × 10 إلى CFU / mL التاسع ، ووجد أن الحمل البكتيري المقاوم للمضادات الحيوية مرتفع. تنتمي العزلات الثقافية المقاومة للمضادات الحيوية المتسلسلة إلى عائلة Enterobacteriaceae ومعظمها الإشريكية القولونية والكلبسيلة الرئوية.

بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد البكتيريا الانتهازية النادرة. أظهر اختبار الحساسية للمضادات الحيوية بطريقة انتشار القرص مؤشر مقاومة متعددة للمضادات الحيوية يبلغ حوالي 0.2 لثماني عزلات ، مما يشير إلى درجة عالية من المقاومة. ومع ذلك ، لم تظهر أنواع Comamonas و Arthrobacter مقاومة لأي من المضادات الحيوية المختبرة.

كشفت العزلات القابلة للزراعة عن وجود جينات مقاومة للمضادات الحيوية تشفر العوامل ضد بيتا لاكتام وتريميثوبريم وأمينوغليكوزيدات. أدى تحليل الحمض النووي الميتاجينومي للتنوع البكتيري الكلي إلى تحديد 50 شعبة ، مما يشير إلى التنوع البكتيري العالي حيث كانت البروتيوباكتريا هي الشعبة الأكثر انتشارا ، والتي تتكون من فئات ألفا بروتيوبكتريا ، وبيتابروتيوبكتريا ، وجامابروتيوبكتيريا. على مستوى الطلب ، كان Burkholderiales هو الأكثر انتشارا ، حيث ينتمي إلى فئة Betaproteobacteria.

على المستوى العام ، كانت Pseudomonas و Acinetobacter و Pedobacter و Prosthecobacter و Limnohabitans و Flavobacterium و Comamonas بعض البكتيريا الوفيرة. كشف تحليل الحمض النووي الميتاجينومي أيضا عن المزيد من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية. في هذه الطريقة ، تعتبر خطوة التخفيف التسلسلي حاسمة لأن أي خطأ يمكن أن يؤدي إلى تفسير خاطئ لإجمالي CFU والحمل البكتيري المقاوم للمضادات الحيوية.

أيضا ، يجب قياس قطر منطقة التثبيط بعناية لتفسير ما إذا كانت العزلة مقاومة أو حساسة بشكل صحيح. باستخدام هذه البروتوكولات ، إلى جانب عينة المياه ، يمكن دراسة أي عينة أخرى ، سواء كانت بيئية أو غذائية أو سريرية. علاوة على ذلك ، إلى جانب البكتيريا ، يمكن أيضا دراسة مجموعات ميكروبية أخرى في أي نظام بيئي باستخدام مناهج مماثلة.