التهجين الفلوري للحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) لتصور الاستعمار الميكروبي والعدوى في أمعاء Caenorhabditis elegans

يعد تلطيخ RNA FISH مفيدا في تصور وتحديد وقياس الميكروبات التي تستعمر أو تصيب C.elegans بشكل طبيعي ، بما في ذلك بكتيريا الميكروبيوم ومسببات الأمراض داخل الخلايا. هذه التقنية بسيطة وسريعة وقوية ، مما يسمح للمرء بتلطيخ الميكروبات وتصورها بشكل فعال في سياق سليم بالكامل. يمكننا استخدام RNA FISH لاكتشاف وتصور بكتيريا ميكروبيوم الأمعاء في C.elegans البرية.

يمكن أن يساعدنا هذا في فهم التفاعلات المماثلة في أنظمة الثدييات. بعد نقل الديدان الخيطية مع الميكروب المطلوب محل الاهتمام ، من ألواح NGM إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، اغسل الديدان الخيطية بإضافة ملليلتر واحد من 1X PBST إلى أنابيب microfuge. قم بتدوير العينات في جهاز طرد مركزي دقيق أو Nanofuge بالسرعة المناسبة.

باستخدام ماصة ، قم بإزالة كل ما عدا 100 ميكرولتر من المادة الطافية. كرر الغسيل باستخدام PBST مرتين إلى ثلاث مرات. لإصلاح الديدان الخيطية باستخدام بارافورمالدهيد ، ابدأ بإضافة 33 ميكرولترا من 16٪ بارافورمالدهيد إلى أنبوب microfuge الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من المادة الطافية فوق حبيبات الديدان الخيطية للحصول على تركيز نهائي قدره 4٪ بارافورمالدهيد.

احتضان العينات التي تحتوي على الديدان الخيطية المستعمرة أو المصابة بالميكروب محل الاهتمام لمدة 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول بارافورمالدهيد وأضف 0.5 ملليلتر من PBST إلى العينات. قم بتدوير العينات في جهاز طرد مركزي دقيق بالسرعة المناسبة كما هو مذكور في مخطوطة النص.

باستخدام ماصة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. أضف 0.5 ملليلتر من PBST إلى العينات الموجودة في أنابيب microfuge. كرر الغسيل باستخدام PBST مرتين إلى ثلاث مرات.

بعد الغسيل الأخير ، قم بتدوير العينات وإزالة المادة الطافية ، تاركا الحبيبات دون إزعاج. بعد ذلك ، قم بإعداد ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتهجين لكل عينة. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين إلى أنابيب microfuge التي تحتوي على حبيبات الديدان الخيطية.

بيليه العينات في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. قم بإعداد 100 ميكرولتر لكل عينة من المخزن المؤقت للتهجين باستخدام مسبار FISH المطلوب إلى تركيز نهائي من 5 إلى 10 نانوجرام لكل مسبار ميكرولتر ودوامة للخلط.

أضف 100 ميكرولتر من مخزن التهجين الذي يحتوي على مسبار FISH إلى كل عينة. تخلط عن طريق تحريك الأنابيب برفق أو قلبها. احتضان العينات طوال الليل في حمام جاف عند 46 إلى 54 درجة مئوية أو خلاط حراري عند 46 إلى 54 درجة مئوية عند 1،200 دورة في الدقيقة.

تحضير ثلاثة ملليلتر من محلول الغسيل لكل عينة. أجهزة الطرد المركزي العينات بالسرعة المناسبة. قم بإزالة المخزن المؤقت للتهجين باستخدام ماصة مع الحرص على ترك حبيبات الديدان الخيطية دون إزعاج.

أضف ملليلتر واحد من محلول الغسيل المحضر لكل عينة. أجهزة الطرد المركزي العينات بالسرعة المناسبة. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل باستخدام ماصة ، مع الحرص على ترك الحبيبات دون إزعاج.

أضف ملليلتر واحد من محلول الغسيل المحضر لكل عينة. احتضان العينات لمدة ساعة واحدة عند 48 إلى 56 درجة مئوية في حمام جاف أو خلاط حراري عند 48 إلى 56 درجة مئوية عند 1،200 دورة في الدقيقة. في حالة الحضانة في حمام جاف ، اقلب الأنابيب برفق كل 15 إلى 20 دقيقة.

أجهزة الطرد المركزي العينات بالسرعة المناسبة. باستخدام ماصة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل ، مع الحرص على ترك الحبيبات دون إزعاج. أضف 100 إلى 500 ميكرولتر من PBST إلى كل عينة.

في هذه المرحلة ، يمكن تخزين العينات في PBST عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع حتى يصبح البروتوكول جاهزا للمتابعة. بيليه العينات بالسرعة المناسبة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBST دون إزعاج حبيبات الديدان الخيطية.

أضف 20 ميكرولترا من وسيط التركيب المضاد للتلاشي باستخدام DAPI إلى العينات. قم بتحميل ماصة سعة 20 ميكرولتر بطرف ماصة سعة 200 ميكرولتر واستخدم مقصا لقطع طرف الماصة للسماح بسحب الديدان الخيطية الكبيرة. باستخدام طرف الماصة المقطوع ، انقل 5 إلى 10 ميكرولتر من الحبيبات على شريحة مجهرية.

قم بتغطيتها بغطاء 22 × 22. لتخزين الشرائح ، أغلق حواف الغطاء بطلاء الأظافر واحتفظ بها في صندوق مظلم عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام مرة أخرى. تحت مجهر تباين التداخل التفاضلي ، تم العثور على سلالة Caenorhabditis tropicalis البرية ليتم استعمارها مع بكتيريا يبدو أنها تلتصق بشكل اتجاهي بظهارة الأمعاء.

تتداخل إشارة الفلورسنت من مسبار 16S rRNA العالمي الأخضر ومسبار أنواع Alphaproteobacteria الأحمر تماما ، مما يشير إلى أن معظم البكتيريا التي تستعمر الأمعاء هي بكتيريا Alphaproteobacteria الملتصقة. يتكون جينوم الحمض النووي الريبي ثنائي الأجزاء لفيروس أورساي من مقاطع RNA1 و RNA2 وتم تطوير مجسات FISH التي تستهدف كلا الجزأين. يظهر بروتين ZIP1 الموسوم ببروتين الفلورسنت الأخضر موضعيا في نوى الأمعاء للخلايا التي تظهر تلطيخ فيروس أورساي FISH الإيجابي في السيتوبلازم.

تظهر العديد من الحيوانات الملطخة بأسماك خاصة بأورساي أو خاصة ب N.parisii للإشارة إلى قوة هذه الإشارة لسهولة القياس الكمي. العدوى المشتركة ل C.elegans مع اثنين من الطفيليات microsporidia باستخدام مجسات خاصة بالأنواع تتنافس على الارتباط ب 18S ، فإن استخدام DAPI لتلطيخ النوى يسمح بتوطين أفضل للعدوى في سياق الحيوان بأكمله ، خاصة بالنسبة للأمعاء التي تحتوي على نوى كبيرة يسهل التعرف عليها. تؤدي العدوى ب N.parisii إلى تطور meronts إلى جراثيم.

يوضح تلطيخ FISH الناتج هياكل صغيرة وكبيرة على شكل قضيب تتوافق على الأرجح مع جراثيم N.parisii ، والتي تكون ملطخة بمجسات خاصة ب N.parisii باللون الأحمر. عند اختيار العامل المثبت ، تذكر أن تثبيت PFA يسمح بالحفاظ بشكل أفضل على التشكل و GFP المعدل وراثيا ، ولكن تثبيت الأسيتون ضروري لتصور sporoplasms. يمكن استخدام RNA FISH لتحديد وتصور البكتيريا التي تستعمر أمعاء C.elegans.

يمكن للباحثين بعد ذلك إجراء المزيد من الفحوصات الجينية لتحديد العوامل المشاركة في هذه التفاعلات بين المضيف والميكروب.