طريقة بيولوجية شبه آلية وقابلة للتكرار لتحديد ترسب الكالسيوم في المختبر

تسمح طريقتنا بقياس ميل التكلس لعينات المرضى باستخدام خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية. سيساعد هذا في دفع البحث في اضطرابات تكلس الأوعية الدموية ، مما يساعد في تطوير علاجات جديدة. تستخدم هذه التقنية الكشف القائم على الفلورسنت ، مما يزيد من الحساسية ويسمح بقياس العينات بمرور الوقت ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى النسخ المتماثلة وزيادة المتانة.

للبدء ، زرع خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية على قوارير زراعة الخلايا غير المطلية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتقسيم الخلايا عند الوصول إلى 70 إلى 90٪ من التقاء. للتقسيم ، اغسل HVSMCs مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.

يضاف التربسين ويحتضن لمدة 2 إلى 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تثبيط تفاعل التربسين عن طريق إضافة مصل يحتوي على وسط. قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 4 دقائق عند 350 RCF وأعد تعليق الحبيبات في وسط صيانة.

بعد تحضير الخلايا للانقسام كما هو موضح ، عد الخلايا وزرعها في صفيحة من 48 بئرا لبدء تجربة التكلس. بعد الحضانة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، اغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام PBS ، مع استنشاق جميع PBS المتبقية بعناية بعد الغسيل الثاني. أضف وسط التكلس برفق واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

تحقق يوميا باستخدام المجهر الضوئي حتى يحدث التكلس. للكشف عن التكلس عبر التصوير ، افتح البرنامج وحدد البروتوكولات وإنشاء جديد. حدد الإجراء وانقر فوق ضبط درجة الحرارة.

اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية والتدرج على 1 درجة مئوية في النافذة المنبثقة وانقر فوق موافق. حدد نوع اللوحة التي تختارها من القائمة المنسدلة. أضف خطوة التصوير بالنقر فوق صورة. حدد الصورة المعكوسة وانقر فوق موافق. أضف ثلاث قنوات تصوير واضبطها على DAPI و RFP و Bright Field.

ضع علامة في مربع المونتاج وقم بتعيين الرقم المطلوب وموقع الصور. قم بتغيير التداخل لتمثيل تغطية أفضل لكل بئر. حدد الآبار التي سيتم تصويرها.

سيتم فتح نافذة جديدة حيث يمكن اختيار الآبار ذات الأهمية. انقر فوق خيارات التركيز لتعيين وضع التركيز البؤري. سيتم فتح نافذة جديدة.

قم بتعيين كل قناة على حدة. بشكل عام ، يتم تركيز الآبار تلقائيا على قناة DAPI. اضبط جميع القنوات الأخرى على ارتفاع بؤري ثابت من القناة الأولى وقم بتعيينه بالنقر فوق موافق. أغلق النافذة.

ابدأ خطوات الضبط المسبق لتقليل البيانات بالنقر فوق تقليل البيانات وحدد المعالجة المسبقة للصورة. اقبل الإعدادات الافتراضية عن طريق تحديد موافق. قم بإعداد خطوة لحساب عدد الخلايا عن طريق تحديد التحليل الخلوي. حدد صور TsF DAPI من القائمة المنسدلة للقناة.

قم بتعيين مزيد من التفاصيل بعد إجراء التصوير. قم بإعداد تحليل إشارة RFP عن طريق تحديد إحصائيات في النافذة المنبثقة خطوة التسمية وحدد TsF RFP كقناة الإدخال. ضع علامة في المربعين القيمة العليا والقيمة الأقل.

ضع علامة في المربع الخاص بالمساحة الإجمالية في القائمة السفلية. حدد لا شيء في عمود تأثير اللون. في النافذة المنبثقة ، انقر فوق مخصص وحدد مربع الخلفية.

اضغط على موافق. للحصول على قراءة عادلة ، قم بتطبيع إشارة RFP لكل خلية بالضغط على النسبة على الجانب الأيسر. في النافذة المنبثقة، حدد المساحة الإجمالية للقياس الكمي لطلب تقديم العروض. لإدخال البيانات 1 من القائمة المنسدلة وحدد عدد الخلايا ك إدخال البيانات 2.

أخيرا ، حدد اسم مجموعة بيانات جديدة واضغط على موافق مرتين. حدد تأثير اللون كما هو موضح سابقا ، وانقر فوق OK.In الزاوية اليسرى العليا ، وحدد ملف واحفظ الملف كنوع ملف بروتوكول. سجل الملاحظات لكل نقطة زمنية بعد حدوث المثيل الأول للتكلس.

اضغط على Read Now في برنامج بدء التشغيل وانقر فوق البروتوكول الحالي. حدد البروتوكول الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. سيطالبك البرنامج بحفظ التجربة.

يمكن القيام بذلك في هذه المرحلة أو لاحقا يدويا بالنقر فوق الزر "حفظ" في الجزء العلوي الأيسر. ستطلب نافذة منبثقة انتظار تسخين النظام. قم بتشغيل وحدة التحكم في غاز ثاني أكسيد الكربون واضبطها على 5٪ بمجرد وصول النظام إلى درجة الحرارة المحددة ، ستظهر مطالبة لإدخال لوحة وقراءتها.

اضغط على إلغاء. نقل اللوحة من الحاضنة إلى جهاز التصوير في صندوق آمن لتجنب الكسر والانسكاب ويتماشى مع لوائح السلامة البيولوجية المحلية لنقل الخلايا الحية في حالة وقوع حادث. ضع اللوحة في قارئ اللوحة.

انقر فوق إجراء. في النافذة المنبثقة، حدد خطوة التصوير المعدة مسبقا. اضبط التركيز والتعرض على قناة DAPI أولا.

قم بإلغاء تحديد مربع التعرض التلقائي في جميع القنوات، ثم انقر على أيقونة المجهر بجوار قناة DAPI. سيتم فتح نافذة جديدة. حدد البئر لتوجيه التركيز.

إذا كانت الإشارة مرئية بالفعل، فانقر أولا فوق التركيز البؤري التلقائي ثم فوق التعرض التلقائي. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم أولا بزيادة التعرض وكرر التركيز التلقائي والتعرض التلقائي. يمكن ضبط التعرض يدويا عن طريق تحديد القائمة المنسدلة التعرض للضوء.

تحقق من الإعدادات على آبار متعددة ، ثم احفظ الإعدادات. اضبط التعرض بنفس الطريقة لجميع القنوات. بالنسبة لقناة RFP ، تأكد من البدء ببئر مع تكلس متوسط إلى مرتفع.

أغلق نافذة الإجراء وحدد الزر الأخضر "اقرأ الآن" في شريط المهام العلوي. احفظ التجربة كما هو موضح في البرنامج. كرر هذه العملية لكل نقطة زمنية.

بينما يقرأ النظام اللوحة ، تتم معالجة جميع الصور تلقائيا في الخلفية. اضبط إعدادات عدد الخلايا عن طريق تحديد صور TsF DAPI لعرضها. حدد البئر المفضل بالنقر المزدوج.

ستظهر نافذة جديدة. حدد إحدى الصور. حدد علامة التبويب تحليل في النافذة المنبثقة.

حدد عدد خلايا التحليل الخلوي وانقر فوق موافق. قم بإلغاء تحديد قنوات RFP و Bright Field. ضع علامة في المربع تمييز الكائنات. انقر فوق خيارات لفتح القائمة.

اضبط عتبة الحجم والشدة لتشمل كل النوى، مع استبعاد الحطام، ثم انقر فوق موافق. انقر فوق تطبيق التغييرات في أسفل اليمين لتطبيق الإعدادات على جميع الصور. وبالمثل ، حدد صورة جيدة مع كمية متوسطة إلى عالية من التكلس. لضبط نسبة الإشارة إلى الضوضاء بشكل أفضل، انقر فوق علامة التبويب تحليل في قائمة المهام.

حدد إحصائيات الصورة. قم بإلغاء تحديد DAPI وقناة الحقل الساطع. انقر فوق خيارات لفتح القائمة.

ضع علامة في المربع القيم المتطرفة للعتبة. لتعيين قيمة العتبة غير الذاتية للإشارة فوق الخلفية، حدد أداة الخط من شريط المهام. ستظهر نافذة.

ارسم خطا عبر رقعة من الإشارة أثناء تضمين منطقة من الخلفية. اضبط القيم العليا والسفلى. احسب الإشارة فوق الخلفية فقط واستبعد إذا كان هناك حطام أو قطع أثرية.

انقر فوق "موافق" وقم بتطبيق التغييرات لنقل الإعدادات إلى جميع الآبار الأخرى. تأكد من تحديد العتبة بدقة في الآبار الأخرى. بمجرد تعيين عدد الخلايا وعتبات طلب تقديم العروض ، قم بتصدير البيانات.

انقر فوق الزر Excel بجوار القائمة المنسدلة لتصدير البيانات مباشرة إلى جدول بيانات. تم الكشف عن مراحل التكلس المختلفة التي تتراوح من الأقل إلى الأعلى وتحليلها. تم رصد التكلس على شكل بقع سوداء باستخدام المجهر الضوئي ، والتي كانت مفيدة للتقييم الأولي وتحديد وقت بدء التصوير.

لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، تم تحليل صور RFP المعالجة لتحديد التكلس. تم الحصول على البيانات من خلال مقارنة شرطين أو أكثر في نفس النقطة الزمنية. تمت تسوية البيانات إلى عدد الخلايا كمنطقة تكلس لكل خلية.

تم تصوير البيانات أيضا على أنها سلسلة زمنية تظهر نفس الحالة في نقاط زمنية مختلفة. من المهم أن تعكس النتائج بعد تقليل البيانات وتحليلها ما يمكن للمرء رؤيته قبل تحويل الصورة والعتبة.