التحفيز الميكانيكي للكائنات متعددة الخلايا من خلال نظام ضغط الموائع الدقيقة عالي الإنتاجية

يشرح هذا البروتوكول كيفية تصنيع واستخدام تقنيات الموائع الدقيقة للاستفادة من الفوائد التجريبية في إنتاجية العينات ، والمعالجة الآلية ، والقدرة على تطبيق الضغط الميكانيكي بدقة مع تصور العينات في نفس الوقت. تقلل هذه التقنية من المعالجة اليدوية للكائنات البيولوجية متعددة الخلايا ، مثل الأجنة والمواد العضوية ، لتثبيتها ومحاذاتها وتصويرها الحي. كما أنه يتيح تطبيق الضغط الميكانيكي عليها لدراسات البيولوجيا الميكانيكية.

يمكن أن يكون تصنيع القوالب ذات ميزات نسبة العرض إلى الارتفاع العالية لشريحة الموائع الدقيقة هذه أمرا صعبا مع تقنيات التصنيع الدقيق التقليدية. يمكن للنصائح الموضحة في مقالة الفيديو هذه التغلب على هذه التحديات. للبدء ، قم بتنظيف رقاقة السيليكون أولا باستخدام الأسيتون ، ثم باستخدام كحول الأيزوبروبيل.

ضع رقاقة السيليكون على طبق تسخين 250 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لخبز الجفاف. قم بتغطية رقاقة السيليكون ب hexamethyldisiloxane في فرن بخار رئيسي.

ضع زجاجة من SU-8 2100 Photoresist في فرن 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتقليل لزوجتها. صب ملليلتر واحد من المقاومة الضوئية الساخنة لكل بوصة من رقاقة السيليكون الموضوعة على اللوحة الساخنة حتى يغطي Photoresist معظم السطح. قم بتطبيق ما قبل الدوران أولا بمعدل 250 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، ثم بسرعة 350 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية أخرى ، وكلاهما بتسارع 100 دورة في الدقيقة في الثانية.

بعد ذلك ، قم بتطبيق الدوران أولا بسرعة 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية مع تسارع 100 دورة في الدقيقة في الثانية ، ثم بسرعة 1،450 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع تسارع 300 دورة في الدقيقة في الثانية. قم بإزالة حبة الحافة بمسحة غرفة نظيفة ، ورش الأسيتون على الرقاقة لإزالة العيوب وتعزيز الطلاء الموحد. قم بتعريض رقاقة السيليكون ل 350 مللي جول لكل سنتيمتر مربع من ضوء الأشعة فوق البنفسجية من خلال قناع الصورة.

باستخدام مصفف قناع التلامس ، ضع الخبز بعد التعرض على رقاقة السيليكون ، واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ضع الكأس الزجاجية داخل دورق أكبر حجما ، واملأ الكأس الأكبر بمحلول مطور جديد. ضع شبكة معدنية على الدورق.

ضع رقاقة السيليكون على الشبكة المعدنية رأسا على عقب. اترك رقاقة السيليكون مغمورة في المطور لمدة 30 دقيقة مع تشغيل المحرك. نقل رقاقة السيليكون إلى سونيكاتور حمام بالموجات فوق الصوتية مليئة المطور الطازج لمدة ساعة واحدة في 40 كيلوهرتز.

ثم أخرج الرقاقة من الدورق واغسلها بمحلول مطور جديد. قم بإعداد محلول PDMS المعالج مسبقا عن طريق خلط قاعدة PDMS مع عامل المعالجة بنسبة 10 إلى واحد. قم بإزالة الخليط عن طريق وضعه في جهاز طرد مركزي لمدة 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

صب PDMS المعالج مسبقا على رقاقة السيليكون ، وقم بتفريغها مرة أخرى. أخيرا ، ضع PDMS غير المعالج في فرن 60 درجة مئوية للمعالجة. استخدم مشرطا لقطع حدود منطقة PDMS المعالجة المقابلة لهندسة رقاقة الموائع الدقيقة.

لكمة فتحات المدخل والمخرج على PDMS باستخدام لكمة خزعة ، أو إبرة ذات طرف حاد. ضع PDMS على الشريحة الزجاجية بحيث يكون سطحها المزخرف متجها نحو الشريحة الزجاجية بعد معالجة البلازما لإغلاق القنوات الدقيقة عبر الترابط التساهمي. اسمح للذباب البالغ في ولاية أوريغون آر بوضع البيض على أطباق أجار عصير التفاح ، وجمع الأطباق في وقت النمو المطلوب بعد وضع البيض للتجربة المحددة.

غمر الآجار بغسل بيض الجنين ، وقم بتحريك الأجنة برفق بفرشاة رسم لإخراجها من أجار. انقل الأجنة إلى محلول مبيض بنسبة 50٪ لمدة 90 ثانية مع التحريك من حين لآخر. صفي الأجنة من خلال غربال الأنسجة ، واغسل محلول التبييض جيدا بالماء.

انقل الأجنة إلى طبق بتري زجاجي عيار 90 ملم مع ما يكفي من غسل بيض الجنين لتغطية الأجنة بالكامل. فحص الأجنة باستخدام الإضاءة العابرة على مجهر تشريح ، واختيار الأجنة في مرحلة النمو المرغوبة لتحميلها في جهاز الموائع الدقيقة. قم بتجهيز جميع القنوات الدقيقة السبعة للأجنة عن طريق ملئها ب 0.4 ميكرومتر من IPA المصفى من خلال منفذ مدخل الجنين الرئيسي.

استبدل IPA ب 0.4 ميكرومتر من الماء منزوع الأيونات المصفى. ثم استبدل ماء DI بمحلول غسل بيض الجنين. اجمع ما يقرب من 100 جنين محدد مسبقا من طبق بتري الزجاجي باستخدام ماصة زجاجية.

بعد ذلك ، ماصة الأجنة في منفذ مدخل الجنين ، وتطبيق ما يقرب من ثلاثة PSI الضغط السلبي على مدخل الغاز باستخدام مضخة تفريغ محمولة لفتح القنوات الدقيقة للجنين. ثم قم بإمالة رقاقة الموائع الدقيقة لأسفل حتى تتم محاذاة الأجنة تلقائيا وتستقر في القنوات الدقيقة للجنين. إذا انسدادت مداخل القناة الدقيقة للجنين بسبب دخول أجنة متعددة في وقت واحد ، فقم بإمالة شريحة الموائع الدقيقة لأعلى ، ثم لأسفل مرة أخرى لإزالة الانسداد.

بناء على الإنتاجية المطلوبة ، أدخل ما يصل إلى 300 جنين في القنوات الدقيقة للأجنة. بمجرد اكتمال تحميل الجنين ، قم بإزالة الفراغ لشل حركة الأجنة. ثم قم بإمالة رقاقة الموائع الدقيقة مرة أخرى إلى الوضع الأفقي.

قم بتوصيل مصدر ضغط إيجابي محمول بمقياس ضغط بمدخل الغاز لتطبيق ضغط ثلاثة PSI. إذا تم إجراء تجارب التصوير الحي على الأجنة المحفزة ميكانيكيا ، فضع شريحة الموائع الدقيقة على حامل منزلق زجاجي قياسي لمرحلة المجهر مع توصيل مدخل الغاز بمصدر الضغط. فحص الأجنة تحت المجهر الفلوري داخل قنوات الموائع الدقيقة.

بمجرد اكتمال تجربة الانضغاط ، يمكن جمع الأجنة لتحليلها في المراحل النهائية. للقيام بذلك ، أولا ، قم بتطبيق الفراغ على مدخل الغاز لتحرير الأجنة. ثم قم بإمالة شريحة الموائع الدقيقة لأعلى حتى تتحرك الأجنة لأسفل نحو منفذ إدخال الجنين.

جمع الأجنة من رقاقة الموائع الدقيقة باستخدام ماصة زجاجية. تم تحديد وظيفة جهاز الموائع الدقيقة تجريبيا عن طريق تحميل أجنة ذبابة الفاكهة في قنوات الضغط وتطبيق ضغط إيجابي على قنوات الغاز. لا تعاني الأجنة من ضغط كبير تحت الفراغ ، أو في حالات الضغط المحايدة.

يتم ضغطها عند تطبيق الضغط الإيجابي. توضح قياسات العرض المتناقص للأجنة تحت المجهر كيف يمكن استخدام ضغط الغاز للحصول على مستوى ضغط مستهدف. تسمح أجهزة الموائع الدقيقة المصنوعة بهذه الطريقة بالتحفيز الكيميائي للعينات الثابتة.

يسمح التحفيز بالتصوير الزماني المكاني العالي. السؤال الأساسي في علم الأحياء التنموي هو كيف تنظم القوى الميكانيكية التعبير الجيني والبروتين أثناء التطور؟ تسمح لنا هذه التقنية بتطبيق التحفيز الميكانيكي على عدد كبير من الأجنة في وقت واحد ، حتى نتمكن من عزل كميات كافية من البروتين والحمض النووي الريبي لإجراء تجارب البروتينات المقارنة ، أو تجارب النسخ.

سيمكن هذا الباحثين من معرفة المزيد عن البروتينات والجينات الحساسة للقوى الميكانيكية.