التحفيز الميكانيكي للكائنات متعددة الخلايا من خلال نظام ضغط الموائع الدقيقة عالي الإنتاجية
December 23rd, 2022
يصف البروتوكول الحالي تصميم وتصنيع وتوصيف نظام الموائع الدقيقة القادر على محاذاة وتجميد وضغط المئات من أجنة ذبابة الفاكهة الميلانية بدقة مع الحد الأدنى من تدخل المستخدم. يتيح هذا النظام تصويرا عالي الدقة واستعادة العينات لتحليل ما بعد التحفيز ويمكن تحجيمه لاستيعاب الأنظمة البيولوجية الأخرى متعددة الخلايا.
يشرح هذا البروتوكول كيفية تصنيع واستخدام تقنيات الموائع الدقيقة للاستفادة من الفوائد التجريبية في إنتاجية العينات ، والمعالجة الآلية ، والقدرة على تطبيق الضغط الميكانيكي بدقة مع تصور العينات في نفس الوقت. تقلل هذه التقنية من المعالجة اليدوية للكائنات البيولوجية متعددة الخلايا ، مثل الأجنة والمواد العضوية ، لتثبيتها ومحاذاتها وتصويرها الحي. كما أنه يتيح تطبيق الضغط الميكانيكي عليها لدراسات البيولوجيا الميكانيكية.
يمكن أن يكون تصنيع القوالب ذات ميزات نسبة العرض إلى الارتفاع العالية لشريحة الموائع الدقيقة هذه أمرا صعبا مع تقنيات التصنيع الدقيق التقليدية. يمكن للنصائح الموضحة في مقالة الفيديو هذه التغلب على هذه التحديات. للبدء ، قم بتنظيف رقاقة السيليكون أولا باستخدام الأسيتون ، ثم باستخدام كحول الأيزوبروبيل.
ضع رقاقة السيليكون على طبق تسخين 250 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لخبز الجفاف. قم بتغطية رقاقة السيليكون ب hexamethyldisiloxane في فرن بخار رئيسي.
ضع زجاجة من SU-8 2100 Photoresist في فرن 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتقليل لزوجتها. صب ملليلتر واحد من المقاومة الضوئية الساخنة لكل بوصة من رقاقة السيليكون الموضوعة على اللوحة الساخنة حتى يغطي Photoresist معظم السطح. قم بتطبيق ما قبل الدوران أولا بمعدل 250 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، ثم بسرعة 350 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية أخرى ، وكلاهما بتسارع 100 دورة في الدقيقة في الثانية.
بعد ذلك ، قم بتطبيق الدوران أولا بسرعة 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية مع تسارع 100 دورة في الدقيقة في الثانية ، ثم بسرعة 1،450 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع تسارع 300 دورة في الدقيقة في الثانية. قم بإزالة حبة الحافة بمسحة غرفة نظيفة ، ورش الأسيتون على الرقاقة لإزالة العيوب وتعزيز الطلاء الموحد. قم بتعريض رقاقة السيليكون ل 350 مللي جول لكل سنتيمتر مربع من ضوء الأشعة فوق البنفسجية من خلال قناع الصورة.
باستخدام مصفف قناع التلامس ، ضع الخبز بعد التعرض على رقاقة السيليكون ، واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ضع الكأس الزجاجية داخل دورق أكبر حجما ، واملأ الكأس الأكبر بمحلول مطور جديد. ضع شبكة معدنية على الدورق.
ضع رقاقة السيليكون على الشبكة المعدنية رأسا على عقب. اترك رقاقة السيليكون مغمورة في المطور لمدة 30 دقيقة مع تشغيل المحرك. نقل رقاقة السيليكون إلى سونيكاتور حمام بالموجات فوق الصوتية مليئة المطور الطازج لمدة ساعة واحدة في 40 كيلوهرتز.
ثم أخرج الرقاقة من الدورق واغسلها بمحلول مطور جديد. قم بإعداد محلول PDMS المعالج مسبقا عن طريق خلط قاعدة PDMS مع عامل المعالجة بنسبة 10 إلى واحد. قم بإزالة الخليط عن طريق وضعه في جهاز طرد مركزي لمدة 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
صب PDMS المعالج مسبقا على رقاقة السيليكون ، وقم بتفريغها مرة أخرى. أخيرا ، ضع PDMS غير المعالج في فرن 60 درجة مئوية للمعالجة. استخدم مشرطا لقطع حدود منطقة PDMS المعالجة المقابلة لهندسة رقاقة الموائع الدقيقة.
لكمة فتحات المدخل والمخرج على PDMS باستخدام لكمة خزعة ، أو إبرة ذات طرف حاد. ضع PDMS على الشريحة الزجاجية بحيث يكون سطحها المزخرف متجها نحو الشريحة الزجاجية بعد معالجة البلازما لإغلاق القنوات الدقيقة عبر الترابط التساهمي. اسمح للذباب البالغ في ولاية أوريغون آر بوضع البيض على أطباق أجار عصير التفاح ، وجمع الأطباق في وقت النمو المطلوب بعد وضع البيض للتجربة المحددة.
غمر الآجار بغسل بيض الجنين ، وقم بتحريك الأجنة برفق بفرشاة رسم لإخراجها من أجار. انقل الأجنة إلى محلول مبيض بنسبة 50٪ لمدة 90 ثانية مع التحريك من حين لآخر. صفي الأجنة من خلال غربال الأنسجة ، واغسل محلول التبييض جيدا بالماء.
انقل الأجنة إلى طبق بتري زجاجي عيار 90 ملم مع ما يكفي من غسل بيض الجنين لتغطية الأجنة بالكامل. فحص الأجنة باستخدام الإضاءة العابرة على مجهر تشريح ، واختيار الأجنة في مرحلة النمو المرغوبة لتحميلها في جهاز الموائع الدقيقة. قم بتجهيز جميع القنوات الدقيقة السبعة للأجنة عن طريق ملئها ب 0.4 ميكرومتر من IPA المصفى من خلال منفذ مدخل الجنين الرئيسي.
استبدل IPA ب 0.4 ميكرومتر من الماء منزوع الأيونات المصفى. ثم استبدل ماء DI بمحلول غسل بيض الجنين. اجمع ما يقرب من 100 جنين محدد مسبقا من طبق بتري الزجاجي باستخدام ماصة زجاجية.
بعد ذلك ، ماصة الأجنة في منفذ مدخل الجنين ، وتطبيق ما يقرب من ثلاثة PSI الضغط السلبي على مدخل الغاز باستخدام مضخة تفريغ محمولة لفتح القنوات الدقيقة للجنين. ثم قم بإمالة رقاقة الموائع الدقيقة لأسفل حتى تتم محاذاة الأجنة تلقائيا وتستقر في القنوات الدقيقة للجنين. إذا انسدادت مداخل القناة الدقيقة للجنين بسبب دخول أجنة متعددة في وقت واحد ، فقم بإمالة شريحة الموائع الدقيقة لأعلى ، ثم لأسفل مرة أخرى لإزالة الانسداد.
بناء على الإنتاجية المطلوبة ، أدخل ما يصل إلى 300 جنين في القنوات الدقيقة للأجنة. بمجرد اكتمال تحميل الجنين ، قم بإزالة الفراغ لشل حركة الأجنة. ثم قم بإمالة رقاقة الموائع الدقيقة مرة أخرى إلى الوضع الأفقي.
قم بتوصيل مصدر ضغط إيجابي محمول بمقياس ضغط بمدخل الغاز لتطبيق ضغط ثلاثة PSI. إذا تم إجراء تجارب التصوير الحي على الأجنة المحفزة ميكانيكيا ، فضع شريحة الموائع الدقيقة على حامل منزلق زجاجي قياسي لمرحلة المجهر مع توصيل مدخل الغاز بمصدر الضغط. فحص الأجنة تحت المجهر الفلوري داخل قنوات الموائع الدقيقة.
بمجرد اكتمال تجربة الانضغاط ، يمكن جمع الأجنة لتحليلها في المراحل النهائية. للقيام بذلك ، أولا ، قم بتطبيق الفراغ على مدخل الغاز لتحرير الأجنة. ثم قم بإمالة شريحة الموائع الدقيقة لأعلى حتى تتحرك الأجنة لأسفل نحو منفذ إدخال الجنين.
جمع الأجنة من رقاقة الموائع الدقيقة باستخدام ماصة زجاجية. تم تحديد وظيفة جهاز الموائع الدقيقة تجريبيا عن طريق تحميل أجنة ذبابة الفاكهة في قنوات الضغط وتطبيق ضغط إيجابي على قنوات الغاز. لا تعاني الأجنة من ضغط كبير تحت الفراغ ، أو في حالات الضغط المحايدة.
يتم ضغطها عند تطبيق الضغط الإيجابي. توضح قياسات العرض المتناقص للأجنة تحت المجهر كيف يمكن استخدام ضغط الغاز للحصول على مستوى ضغط مستهدف. تسمح أجهزة الموائع الدقيقة المصنوعة بهذه الطريقة بالتحفيز الكيميائي للعينات الثابتة.
يسمح التحفيز بالتصوير الزماني المكاني العالي. السؤال الأساسي في علم الأحياء التنموي هو كيف تنظم القوى الميكانيكية التعبير الجيني والبروتين أثناء التطور؟ تسمح لنا هذه التقنية بتطبيق التحفيز الميكانيكي على عدد كبير من الأجنة في وقت واحد ، حتى نتمكن من عزل كميات كافية من البروتين والحمض النووي الريبي لإجراء تجارب البروتينات المقارنة ، أو تجارب النسخ.
سيمكن هذا الباحثين من معرفة المزيد عن البروتينات والجينات الحساسة للقوى الميكانيكية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يشرح هذا البروتوكول تصميم واستخدام نظام ميكروفلويديك لتنظيم وتثبيط أجنة ذبابة الفاكهة السوداء الشائعة. يسمح بتصوير عالي الدقة واستعادة العينة مع تقليل المناولة اليدوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الميكروفلويديك
- ميكانوبيولوجيا
- تصوير الأجنة
الخلفية
- تعزز تقنيات الميكروفلويديك الإنتاجية والعينة والتعامل الآلي.
- تطبيق الإجهاد الميكانيكي الدقيق ضروري لدراسات الميكانوبيولوجيا.
- يمكن أن تكون تقنيات التصنيع الدقيق التقليدية صعبة بالنسبة للميزات ذات نسبة العرض إلى الارتفاع العالية.
- يوفر هذا البروتوكول نصائح للتغلب على هذه التحديات.
هدف الدراسة
- لتصنيع نظام ميكروفلويديك لتثبيط الأجنة وتنظيمها.
- لتمكين التصوير الحي للكائنات متعددة الخلايا.
- لتطبيق الضغط الميكانيكي للتحليل الميكانوبيولوجي.
الطرق المستخدمة
- تنظيف شرائح السيليكون بالأسيتون وكحول الأيزوبروبيل.
- تصنيع قوالب للرقائق الميكروفلويديك.
- تنظيم وتثبيط الأجنة.
- تصوير عالي الدقة أثناء تطبيق الإجهاد الميكانيكي.
النتائج الرئيسية
- التنظيم والتثبيط الناجح لمئات الأجنة.
- قدرات التصوير عالية الدقة الموضحة.
- تطبيق فعال للضغط الميكانيكي للتحليل.
- تأكيد قابلية التوسيع إلى أنظمة بيولوجية متعددة الخلايا أخرى.
الاستنتاجات
- يقلّل النظام الميكروفلويديك بشكل كبير من المناولة اليدوية.
- يعزز القدرة على دراسة الميكانوبيولوجيا في الأجنة.
- يمكن تكييف هذه النهج لكائنات متعددة الخلايا مختلفة.
الأسئلة المتكررة
Executive Industry Relevance
High-throughput microfluidic compression systems enable scalable mechanostimulation of multicellular organisms, addressing a critical bottleneck in mechanobiology and developmental biology research. This technology enhances predictive confidence in gene and protein expression studies by allowing precise, parallelized mechanical perturbation and quantitative analysis. Its integration supports robust target validation and de-risking at early discovery and preclinical inflection points in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of mechanosensitive pathways in whole-organism models.
- Supports functional target validation by correlating mechanical stimuli with gene and protein expression changes.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses through high-throughput, quantitative outputs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, immobilized biological systems for downstream screening workflows.
- Standardizes mechanical stimulation protocols to ensure reproducibility and quantitative comparability.
- Enables scalable sample processing for omics-based assay development and compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanostimulation outputs with disease-relevant gene and protein expression profiles.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling large-scale, parallel sample analysis.
- Provides mechanistic de-risking for translational biomarker identification in multicellular systems.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic compression system fits from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and high-throughput sample preparation for omics analyses.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing by enabling controlled mechanical perturbation and quantitative readouts.
- Screening: Delivers reproducible, scalable sample immobilization and stimulation for assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative measurements of mechanical response, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by supporting large-scale, mechanistically informed biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse multicellular model systems and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and automates sample handling, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by supporting robust, quantitative mechanobiology data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mechanistically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics fabrication and mechanobiology experimental design.
- Needs access to high-resolution imaging and pressure-controlled microfluidic instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis workflows.
- Adaptable geometry allows use across various multicellular model systems.
- Sample throughput and device scalability are limited by fabrication and handling infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Preparation of the Silicon Wafer Mold
3:31
Fabrication of the Microfluidic Chip
4:39
Preparation of the Fruit Fly Embryos
5:47
Applying Mechanical Stimulation to Fruit Fly Embryos Using the Microfluidic Chip
8:19
Results: Experimental Measurement of Embryo Compression Level
8:58
Conclusion
