فك رموز الآلية الجزيئية ووظيفة السموم المكونة للمسام باستخدام الليشمانيا الكبرى

آلية مقاومة السموم المكونة للمسام غير مفهومة بشكل جيد. يتيح بروتوكولنا وظيفة وآلية تكوين السموم باستخدام نظام الليشمانيا الكبرى ، وهو نظام قابل للتتبع وراثيا وذو صلة من الناحية الفسيولوجية. الميزة الرئيسية لمقايسة السمية الخلوية هي مقارنة صلاحية الخلية لأنماط ظاهرية متعددة على مستوى خلية واحدة في مقايسة متوسطة الإنتاجية عند تحديها بالسموم في الوقت الفعلي.

العوامل المسببة للاضطراب في الغشاء مثل الأمفوتريسين B هي علاجات الخط الأمامي لليشمانيا. يتيح هذا الفحص تحديد العوامل التي تحفز الأمفوتريسين B و / أو العوامل الجديدة الضارة بالغشاء. يوفر هذا الفحص نظرة ثاقبة لمجالات مثل استجابة الإصلاح ومسارات الإشارات المتعلقة باستجابات الإصلاح.

يمكن تطبيق هذا الفحص على الأوليات مثل المثقبيات والنيجلرية الداجنة. يجد الناس صعوبة في فهم سلسلة التخفيف التسلسلي للسموم. لذا فإن أفضل نصيحة يمكنني تقديمها هي رسم تخطيطي لسلسلة التخفيف التسلسلي قبل إعداد التجربة.

للبدء ، احتفظ ب 0.5 ملليلتر من promastigotes المعالجة في أنبوب منفصل كتحكم غير ملوث. أضف ملليغرام لكل ملليلتر بروبيديوم يوديد ، أو PI ، إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل ملليلتر إلى promastigotes المتبقية. دوامة لمدة ثلاث ثوان.

أضف promastigotes المعالجة إلى كل بئر من قاع V أو لوحة 96 بئر أو أنابيب المستنقعات ، وضع اللوحة أو رف الأنبوب على الجليد بزاوية 45 درجة تقريبا من المشاهدة. أضف 100 ميكرولتر من مخزن الفحص المؤقت مع يوديد البروبيديوم إلى كل عنصر تحكم خال من السموم. تحقق من إضافة عنصر التحكم بشكل صحيح عن طريق التعرف بصريا على الأنابيب ذات الحجم الإجمالي 200 ميكرولتر والتي تظهر أغمق في اللون.

أضف حجم السم إلى أعلى تخفيف. ثم ، تمييع السم بشكل متسلسل. ماصة لأعلى ولأسفل ثماني مرات على الأقل لضمان الخلط.

بدءا من أدنى تركيز للسموم ، أضف بسرعة 100 ميكرولتر من السم إلى الصف الصحيح ، واستمر حتى تتم إضافة كل السم إلى الخلايا. ختم اللوحة بشريط مانع للتسرب. بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، قم بتعبئة اللوحة ونقلها إلى مقياس التدفق الخلوي.

للحصول على البيانات ، ابدأ بإعداد مقياس التدفق الخلوي وبرنامج الاستحواذ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وسياسة كل منشأة. باستخدام عينة L.major promastigote غير الملوثة ، اضبط بوابات التشتت الأمامي والجانبي ومعلمات الفلورسنت الأولية بناء على الأصباغ المختارة. باستخدام أدوات تحكم ذات صبغة واحدة ، اضبط بوابات صبغة الصلاحية وأي سموم تحمل علامة الفلورسنت.

راقب التشتت الأمامي مقابل الوقت للسجلات الدقيقة ، واحصل على أكثر من 10،000 حدث مسور لكل عينة على مقياس الخلايا. لتحليل البيانات ، بوابة مجموع خلية واحدة L.major promastigotes عن طريق بوابة على التشتت الأمامي والجانبي والوقت حسب الحاجة. استخدم الارتفاع أو المساحة على النحو الموصى به لمقياس التدفق الخلوي.

تحديد وبوابة الخلايا الميتة على أنها PI عالية. تنظيم منحنى الجرعة والاستجابة في Excel للتحليل. حدد متوسط النسبة المئوية ل PI عالية لكل شرط بين التكرارين الفنيين.

قم بتضمين تركيز السم ومتوسط التحلل النوعي للنسبة المئوية ، جنبا إلى جنب مع التفاصيل التجريبية و / أو الحسابات العالية لنسبة PI الخام. قم بتسمية أربعة أعمدة أخرى كقيم نموذجية وبقايا ومعلمات ومعلمات. تحقق من أن الأعمدة الأولى تتوافق مع المعلمات التجريبية وتركيز السم والتحلل النوعي بالنسبة المئوية.

قم بتهيئة المعلمات L وk وc عن طريق إدخال القيم في عمود قيم المعلمات. في العمود نموذج، قم بإنشاء النموذج اللوجستي. في عمود المتبقيات، احسب مربع الفرق بين الرقم النموذجي والتحلل المحدد الفعلي.

في العمود قيم المعلمات، بجوار SUM، اجمع كل القيم الموجودة في عمود المتبقيات. في عمود قيم المعلمات، بجوار LC50، قم بتهيئة المعادلة لحساب LC50 من القيم المحددة. افتح Solver من علامة التبويب البيانات.

حدد الهدف المحدد ليكون الخلية التي تحتوي على مجموع البقايا المحسوبة. اضبطه على Min. قم بتغيير الخلايا المتغيرة لقيم المعلمات L و k و c.

بالنسبة لقيم k السالبة ، قم بتعديل المعادلات عن طريق تحليل سالب واحد من k لتغيير k إلى موجب. استخدم طريقة الحل غير الخطي GRG، وانقر فوق حل. تحقق من المنحنى وأن LC50 يتم حسابه تلقائيا.

تحقق من الملاءمة عن طريق رسم بياني لكل من التحلل النوعي للنسبة المئوية والنمذجة مقابل تركيز السموم. كانت promastigotes SPT2 التي تعاني من نقص السفينغوليبيد حساسة ل SLO في كل من M199 الخالي من المصل ومخزن Tyrode. كان النوع البري و SPT2 promastigotes الإضافي مقاوما ل SLO في M199 الخالي من المصل ولكن كان لديه أقل من 20٪ تحلل محدد في مخزن Tyrode.

كانت promastigotes بالضربة القاضية SPT2 أكثر حساسية بثمانية أضعاف تقريبا ل SLO في المخزن المؤقت ل Tyrode مقارنة ب M199. توضح هذه البيانات أن حساسية السموم قد تختلف بناء على المخزن المؤقت المستخدم. لوحظ وجود نطاق 120 كيلودالتون لفوسفو-مجاهدي خلق في L.major promastigotes.

بالنسبة لإجمالي مجاهدي خلق ، لوحظت نطاقات عند حوالي 120 كيلودالتون و 55 كيلو دالتون ، والتي تتوافق مع أحجام MRK1 و LmxMKK ، على التوالي. اكتشف Phospho-ERK نطاقات مماثلة ، في حين أن تلطيخ الأجسام المضادة ERK لم يكن قويا في هذا الفحص. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو ضمان التعامل السليم مع السم.

يمكن استخدام الليشمانيا كنموذج قابل للتتبع وراثيا لدراسة إصلاح غشاء البلازما ، مما يوفر رؤى جديدة في ميكانيكا إصلاح الغشاء أثناء تفاعل بكتيريا الليشمانيا في الأمعاء الوسطى لذبابة الرمل.