نهج التصوير الفلوري داخل الحيوية لدراسة ديناميكيات إشارات الكالسيوم الناجمة عن الحمل في خلايا العظام في الفئران
فبراير 24, 2023
تصف المقالة الحالية إجراء نهج تصوير داخل الحيوية لمراقبة إشارات الكالسيوم المستحثة ميكانيكيا لخلايا العظم المدمجة في الجسم الحي في الوقت الفعلي استجابة للتحميل الميكانيكي على مستوى الأنسجة لمشط القدم الثالث للفأر.
يوفر هذا البروتوكول طريقة لمراقبة الخلايا العظمية المدمجة في الجسم الحي التي تمثل تقدما مهما في دراسة البيولوجيا الميكانيكية للعظام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على مراقبة أحداث المستوى الخلوي والجزيئي في الخلايا العظمية في الجسم الحي ، والحفاظ على ترتيبها المكاني ثلاثي الأبعاد الأصلي ، وتدفق الدم ، وظروف الغدد الصماء ، والتغلب على القيود التي تفرضها عادة التجارب الخلوية في المختبر. تم تصميم هذه التقنية للتحقيق في العلوم الأساسية في نماذج الفئران. إنها لا تمتد إلى العلاج أو التشخيص حتى الآن ، ولكنها توفر الفرصة للرؤى التي تحدد الجيل القادم من علاجات العظام.
[الراوي] للبدء ، قم بعمل شق مشرط عبر الأدمة بين مشط القدم الثاني والثالث ، بدءا من النهاية البعيدة ويتقدم بشكل قريب على طول العظام. باستخدام الملقط ، افتح موقع الجراحة عن طريق سحب الجلد نحو الحواف الإنسية أو الجانبية. استئصال الأوتار الباسطة باستخدام مقص Vannas المستقيم لكشف مشط القدم الثالث. أدخل دبوس نقطة الارتكاز المركزي لجهاز تحميل مشط القدم في المساحة الصغيرة في الطرف البعيد حيث يلتقي مشط القدم الثالث بالكتائب القريبة. ثم حرك الدبوس بشكل قريب حتى يستقر في منتصف العمود من مشط القدم الثالث. احرص بشكل خاص على ضمان واجهة مباشرة بين العظم والدبوس ، باستثناء أي عضلات ولفافة. أمسك الكاحل بالملقط وضع القدم في حمام مائي مملوء ب DPBS. قم بتثبيت المخلب في مكانه باستخدام كتيفة التحميل وقم بتوصيل الحامل بترتيب خلية تحميل المشغل. التقط إعداد جهاز التحميل بعناية باستخدام الماوس وضعه على منصة المجهر. ابدأ بهدف التكبير المنخفض في وضع التألق لتحديد موقع الحجاب الحاجز الأوسط للعظم وتوسيطه. بعد تحديد منطقة الاهتمام ، قم بالتبديل إلى تكبير موضوعي غمر أعلى في الماء وقم بتبديل البصريات إلى فوتونين. اضبط كثافة البكسل باستخدام إعدادات التحكم في منطقة Galvo/Resonance. لتجنب تبييض الصور ، قم بتقليل الطاقة باستخدام خيار التحكم في الطاقة وزيادة تضخيم PMT في إعدادات التحكم في الماسح الضوئي Galvo / Resonance. حدد سطح العظم في وضعين فوتونيين من خلال البحث عن التألق الذاتي للسمحاق الليفي في القناة الخضراء التي تستخدم مرشح تمرير النطاق المتمركز عند 525 نانومتر. إذا كانت هناك حركة مرئية للعظم أثناء التحميل ، فحدد منطقة اهتمام مختلفة على طول الاتجاهين Y أو Z للتأكد من أنها مباشرة فوق دبوس نقطة الارتكاز المركزي. إذا استمرت الحركة ، اضبط الوضع الجراحي للدبوس يدويا أسفل مشط القدم الثالث. قم بإجراء تصوير مكدس Z مع التحميل وفقا للتصميم التجريبي لتسجيل أحداث الإشارات المورفومترية ، ثم تصوير سلسلة T مع التحميل لتسجيل أحداث الإشارات المستحثة عن الحمل الديناميكي. تظهر هنا صورة فوتونين ذات مستوى واحد لخلايا عظم مشط القدم تعبر عن GCaMp6f في الجسم الحي. يوفر التعبير الذاتي لتركيبات مراسل الكالسيوم هدفا فلوريا دون الحاجة إلى الحضانة. يتم عرض إسقاط 3D Z للخلايا العظمية في الجسم الحي الذي تم التقاطها باستخدام اثنين من المجهريات الفوتونية في هذا الشكل. يظهر القطع العرضي في المستوى XY والقطع السهمي عمق مكدس Z. تظهر الصورة التمثيلية مثالا على المسار الزمني لإشارة الفلورسنت GCaMp6f من خلية عظمية مدمجة. في حالة الراحة ، تظهر تقلبات صاخبة منخفضة المستوى. مع التحميل ، تزداد تقلبات الكالسيوم من حيث الحجم والانتظام ، وغالبا ما تحدث بالتزامن مع التحميل المطبق.
تمهد هذه الطريقة الطريق للباحثين للإجابة على الأسئلة الوظيفية المتعلقة بالبيولوجيا الميكانيكية للخلايا العظمية في الجسم الحي والتي كانت ممكنة سابقا فقط في المختبر أو خارج الجسم الحي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تُقدم هذه المقالة بروتوكولاً للتصوير الحي داخل الجسم لمراقبة إشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية استجابةً للتحميل الميكانيكي في الجسم الحي. ويتيح هذا التقدم مراقبة الأحداث الخلوية في الوقت الفعلي مع الحفاظ على البيئة الأصلية للعظم.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- الميكانيكا الحيوية للعظام
- تقنيات التصوير الحي
- إشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية
خلفية علمية
- تلعب الخلايا العظمية دوراً محورياً في الميكانيكا الحيوية للعظام.
- تحد الطرق التقليدية المختبرية من فهم الاستجابات الخلوية في بيئتها الأصلية.
- تتيح هذه التقنية مراقبة الخلايا العظمية مع الحفاظ على ترتيبها المكاني ثلاثي الأبعاد وظروفها الفسيولوجية.
- قد تساهم الرؤى المكتسبة في توجيه استراتيجيات علاج العظام المستقبلية.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لمراقبة الخلايا العظمية (osteocytes) حيًا أثناء التحميل الميكانيكي.
- تعزيز فهم ديناميكيات إشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية.
- توفير أساس للأبحاث المستقبلية في صحة العظام وأمراضها.
الطرق المستخدمة
- شق بالمشرط للوصول إلى المشط الثالث في الفئران.
- استخدام جهاز تحميل مشطي لتسليط إجهاد ميكانيكي.
- المجهر ثنائي الفوتون لتصوير الخلايا العظمية في الوقت الفعلي.
- رصد أحداث التأشير الناتجة عن الحمل الديناميكي من خلال تصوير Z stack وT series.
النتائج الرئيسية
- كشف التصوير في الوقت الفعلي عن تقلبات الكالسيوم في الخلايا العظمية أثناء التحميل.
- زادت شدة الإشارات الفلورية مع الإجهاد الميكانيكي.
- وفر التصوير ثلاثي الأبعاد رؤى حول الترتيب المكاني للخلايا العظمية.
- أثبت فعالية هذه التقنية في دراسة البيولوجيا الميكانيكية للعظام.
الاستنتاجات
- يتيح هذا البروتوكول تحقيق تطورات ملحوظة في دراسة الميكانيكا الحيوية للعظام.
- يمكن أن يؤدي التصوير الحي في الوقت الحقيقي للخلايا العظمية إلى فهم أفضل لصحة العظام.
- قد تمهد هذه التقنية الطريق لاستراتيجيات علاجية مستقبلية في علاج العظام.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يعالج التصوير المباشر داخل الجسم (in vivo) لإشارات الكالسيوم في الخلايا العظمية تحت تأثير الحمل الميكانيكي فجوة حرجة في فهم عملية نقل الإشارات الميكانيكية في العظام على المستوى الجزيئي. وتعزز هذه القدرة الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال تمكين المراقبة الآنية لمسارات الاستشعار الميكانيكي في سياقها الفسيولوجي الطبيعي. ويدعم هذا النهج الحد من المخاطر الميكانيكية ويساهم في التحقق من الأهداف العلاجية لمحافظ صحة العظام وأمراض الجهاز الهيكلي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يسمح باستقصاء مسارات الاستشعار الميكانيكي للخلايا العظمية في سياق ذي صلة فسيولوجياً.
- يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال الحفاظ على البنية الأصلية ثلاثية الأبعاد والتأثيرات الجهازية.
- يسهل التحقق الوظيفي من الأهداف الخاصة بآليات تحويل الإشارات الميكانيكية في العظام.
- يعزز الثقة التنبؤية لتحديد أولويات الأهداف المتعلقة بالعظام.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر نظاماً تم التحقق من صحته في الجسم الحي (in vivo) لقياس ديناميكيات إشارات الكالسيوم استجابةً لأحمال ميكانيكية محددة.
- يتيح قراءات كمية وقابلة للتكرار لنشاط الخلايا العظمية من أجل تطوير المقايسات اللاحقة.
- يدعم توحيد مقايسات نقل الإشارات الميكانيكية لتقييم المركبات.
- يضع الأساس للفحص القابل للتطوير للمنظمات التي تؤثر على الحساسية الميكانيكية للعظام.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يربط الرؤى الميكانيكية بنماذج العظام ذات الصلة بالمرض لضمان الاستمرارية الانتقالية.
- يتيح التقدم المدروس للمداخلات التي تستهدف العظام بناءً على البيانات الميكانيكية المستمدة من الدراسات الحية in vivo.
- يدعم تحديد المؤشرات الحيوية الانتقالية المرتبطة بديناميكيات إشارات الخلايا العظمية.
- يجسر الفجوة بين نتائج مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري في الأنظمة السليمة.
تكامل سير العمل والمسارات التحليلية
تتكامل طريقة التصوير الحي داخل الجسم هذه عند نقطة التلاقي بين الاكتشاف المبكر والأبحاث قبل السريرية، مما يتيح اختبار الفرضيات بشكل مباشر وتوضيح المسارات في أنسجة العظام الحية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات الميكانيكية لاستجابات الخلايا العظمية للمحفزات الميكانيكية داخل الجسم الحي.
- الفحص: يوفر قياسات كمية وقابلة للتكرار لإشارات الكالسيوم لضمان جاهزية المقايسة.
- التحليلات: يوفر قراءات فلورية ديناميكية لمقارنة الإشارات تحت ظروف تحميل مختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط أحداث الإشارات الجزيئية بالنتائج الوظيفية للعظم ككل في النماذج ذات الصلة بالأمراض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لدراسات البيولوجيا الميكانيكية عبر برامج أبحاث العظام.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في أبحاث تحويل الإشارات الميكانيكية في العظام.
- القيمة التشغيلية: توحد سير عمل التصوير الحي لضمان القابلية للتكرار والتوسع.
- القيمة الاستراتيجية: تسترشد بها قرارات المضي قدماً أو التوقف، وتعزز كفاءة رأس المال في البحث والتطوير الموجه للعظام.
- تأثير المحفظة: تمكن من تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لأصول صحة العظام وأمراض الهيكل العظمي.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التصوير الحي داخل الجسم وتقنيات الجراحة للحيوانات الصغيرة.
- يتطلب الوصول إلى مجهر ثنائي الفوتون وأجهزة تحميل ميكانيكية دقيقة.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يتعلق ببارامترات التصوير وتحليل البيانات.
- قد يتطلب التكيف مع مواقع عظمية أخرى أو نماذج أخرى تحسيناً للبروتوكول.
- يقتصر على أبحاث العلوم الأساسية في نماذج الفئران وفقاً لما تدعمه البيانات الحالية.
