كريسبر / كاس 9 بوساطة استهداف الجينات عالية الكفاءة في الخلايا الجذعية الجنينية لتطوير نماذج الفئران التلاعب بالجينات
أغسطس 24, 2022
نقدم هنا بروتوكولا لتطوير نماذج الفئران المعدلة وراثيا باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية ، خاصة بالنسبة لضربات الحمض النووي الكبيرة (KI). تم ضبط هذا البروتوكول باستخدام تحرير جينوم CRISPR / Cas9 ، مما أدى إلى تحسين كفاءة KI بشكل كبير مقارنة بطريقة استهداف الحمض النووي الخطي التقليدية بوساطة إعادة التركيب المتماثل.
إن إنتاج الفئران المعدلة وراثيا وتحليل نمطها الظاهري يمكننا من فهم وظائف جينية محددة بالتفصيل ، في الجسم الحي. تم الكشف عن العديد من النتائج المهمة باستخدام نماذج حيوانية معدلة جينيا. الطريقة التي نصفها هنا تمكن الحمض النووي الطويل من زرع الخلايا الجذعية بكفاءة مقبولة دون اختيار الدواء.
هذه التقنية مفيدة ليس فقط لعلوم الحياة الأساسية ، ولكن سيتم أيضا تنفيذ النتائج في العلوم التطبيقية مثل العلوم الطبية وعلوم الحيوان. سيوضح الإجراء الدكتور شيهيرو إيموري ، أستاذ مساعد ، والدكتور مانابو أوزاوا ، أستاذ مشارك من مختبري. بعد تحضير الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، قم بإعداد طبق زراعة الخلايا المغلفة بالجيلاتين كما هو موضح في المخطوطة واحتضانه لمدة ساعتين في حاضنة رطبة.
قم بإزالة محلول الجيلاتين ، واغسل الطبق مرتين باستخدام PBS ، وقم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. قم بإذابة مخزون MEF المجمد المعطل بشكل انقسامي باستخدام حمام مائي مخفف عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. قبل يوم واحد من بذر ESC ، ضع MEF على طبق 60 ملم مغطى بالجيلاتين.
قم بإذابة أنبوب مخزون ESC المجمد كما هو موضح سابقا وضع واحد في 10 إلى ESCs الخامس على طبق 60 ملم يحتوي على MEF المصنف مسبقا. ثم أضف أربعة ملليلتر من وسط استزراع ESC واحتضن الطبق حتى يصل ESC إلى 50 إلى 70٪ من التقاء. بعد غسل ESC المستزرع بأربعة ملليلتر من PBS ، اهضمها ب 800 ميكرولتر من محلول 0.25٪ تربسين EDTA لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.
بمجرد تعطيل التربسين بملليلتر واحد من ESCM ، أضف ملليلترا واحدا من ESCM الطازج إلى الخلايا ، وانقل الوسط إلى أنبوب ، وقم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 280 جم لمدة خمس دقائق. بعد إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من ESCM الطازج ، احسب تركيز الخلية باستخدام عداد الخلايا مع تلطيخ التريبان الأزرق. بعد نقل واحد في 10 إلى ESCs الخامس إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر وغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS عن طريق الطرد المركزي ، أعد تعليق حبيبات ESC في 12 ميكرولتر من خليط الحمض النووي Cas9 RNP واخلطها جيدا عن طريق السحب اللطيف لتجنب الفقاعات.
ثم ، قم بخدمة ESC المعلق للتثقيب الكهربائي. بعد ذلك ، قم بزراعة ESCs المثقوبة بالكهرباء في طبق 60 ملم يحتوي على أربعة ملليلتر من ECSM مع MEF المعطل بشكل انقسامي واستمر في تغيير الوسيط يوميا. بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من التثقيب الكهربائي ، اغسل ESCs بأربعة ملليلتر من PBS ثم اهضمها ب 800 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين EDTA واستزراعها في حاضنة رطبة.
بعد ذلك ، أضف ملليلتر من ESCM لوقف هضم التربسين. بمجرد تكوير خليط الخلية, أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من ESCM الطازج واحسب تركيز الخلية باستخدام عداد الخلايا مع تلطيخ التريبان الأزرق. قم بتمرير ESCs مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثالثة لكل طبق 60 ملم يحتوي على ESCM ومغذي MEF.
تأكد من تغيير الوسيط حتى تلتقط المستعمرة. بعد خمسة إلى سبعة أيام من المقطع الأول ، بمجرد استنشاق ESCM من طبق ثقافة ESC ، أضف أربعة ملليلتر من PBS. باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر ، التقط مستعمرات ESC مفردة بخمسة ميكرولتر من PBS تحت مجهر مجسم.
ضع المستعمرات الفردية في بئر من صفيحة مستديرة القاع مكونة من 96 بئرا تحتوي على 15 ميكرولتر من محلول 0.25٪ تربسين EDTA. بعد احتضان لوحة 96 بئر ، توقف عن هضم التربسين بإضافة 80 ميكرولتر من ESCM وفصل مستعمرات ESC إلى خلايا مفردة عن طريق السحب. بالنسبة للتنميط الجيني PCR ، انقل 40 ميكرولترا من معلق ESC إلى لوحة 96 بئرا مغلفة بالجيلاتين وخالية من التغذية تحتوي على 50 ميكرولترا من ESCM لكل بئر.
لعمل مخزون ESC المجمد ، انقل ال 60 ميكرولترا المتبقية من معلق ESC إلى بئر من صفيحة 24 بئرا مغلفة بالجيلاتين تحتوي على 500 ميكرولتر من ESCM ومغذي MEF. قم بتخزين مستنسخات ESC الفردية المستزرعة في لوحة 24 بئرا حتى تصل إلى 60 إلى 80٪ من التقاء واستعادة استنساخ ESC الفردي عن طريق التربسين ، كما هو موضح سابقا. بعد الحصول على حبيبات الخلية عن طريق الطرد المركزي ، أعد تعليق 500 ميكرولتر من وسط تجميد الخلايا لتجميد الخلايا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
بالنسبة للتنميط الجيني PCR ، يتم استنساخ ESC كما هو موضح سابقا وإزالة ESCM من كل بئر عن طريق الشفط قبل غسله ب 100 ميكرولتر من PBS مرتين. بعد استنشاق PBS ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل الذي يحتوي على بروتيناز K واخلطه جيدا. الآن انقل محللة ESC إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر واحتفظ به في غرفة حرارية عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
بمجرد إذابة الحمض النووي الجينومي في 20 ميكرولترا من الماء الخالي من DNase ، حدد نقاء وتركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بعد إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الجينومي باستخدام مجموعات أولية خاصة بالموقع لتضخيم المنطقة المستهدفة ، تحقق من التسلسل واختر استنساخ ESC مع تسلسل الضربة القاضية المطلوب. بعد تزاوج الإناث المعالجة بالهرمونات مع ذكور ICR وجمع قناة البيض ، ضع قنوات البيض المجمعة في قطرات FHM واستعد الأجنة المكونة من خليتين أو أربع خلايا عن طريق شطف قناة البيض باستخدام FHM باستخدام إبرة تنظيف يتم إدخالها في infundibulum.
اغسل الأجنة المجمعة عن طريق نقلها إلى عدة قطرات FHM جديدة باستخدام ماصة الفم. تسقط زراعة الأجنة في 50 ميكرولتر من KSOM على طبق زراعة خلايا 35 ملم مغطى بالزيت المعدني كما هو موضح في وقت سابق لمدة يوم واحد حتى يتم الوصول إلى مرحلة الخلايا الثماني أو التوتية. تحضير الماصات الزجاجية لعقد الأجنة وحقن ESC باستخدام مجتذب و microforge.
بعد دمج ماصة تحتوي على FHM في حامل شعري متصل بحاقن دقيق ، قم بإعداده على الجانب الأيسر من المعالج الدقيق. قم بتوصيل ماصة الحقن بحاقن دقيق آخر وقم بإعداده على الجانب الأيمن. قم بمحاذاة الماصتين بشكل مستقيم في مجال رؤية المجهر.
اصنع قطرات من خمسة ميكرولتر من البولي فينيل بيروليدون بنسبة 12٪ وقطرات من FHM بخمسة ميكرولتر على نفس غطاء طبق 60 ملم ، جنبا إلى جنب. غطي القطرات بالزيت المعدني. انقل الأجنة في خمسة ميكرولتر من قطرة FHM وأضف من واحد إلى خمسة ميكرولتر من معلق ESC إلى قطرة FHM المحتوية على الجنين.
بمجرد غسل ماصة الحقن بالبولي فينيل بيروليدون ، انقل ماصة الحقن إلى القطرة التي تحتوي على الأجنة و ESCs. اختر ثلاثة ثنائيات ESC فردية أنهت للتو انقسامها الخلوي في ماصة الحقن. باستخدام ماصة الإمساك ، امسك جنينا مكونا من ثماني خلايا أو مرحلة التوتية أكمل الضغط عن طريق الشفط وقم بعمل ثقب في المنطقة الشفافة بنبضة كهرضغطية.
طرد ESC ذو الخلايا الست داخل المنطقة الشفافة واسحب الماصة من الأجنة. اغسل الأجنة المحقونة ب ESC بعدة قطرات KSOM بلطف باستخدام ماصة الفم واحتضانها في قطرة KSOM جديدة سعة 50 ميكرولتر مغطاة بالزيت المعدني ، كما هو موضح سابقا ، حتى تتطور الأجنة إلى مرحلة الكيسة الأريمية. تم الحصول على amplicon PCR بحجم خاص بهدف الضربة القاضية وأظهرت 9 من أصل 22 نسخة مستنسخة نطاقا محددا.
هذه النتائج فعالة وقابلة للتكرار لضرب الجينات دون أي اختيارات للدواء. يعد التقاط الحجم الأمثل لمستعمرات ESC أمرا مهما للغاية لهذا الإجراء. تجنب اختيار مستعمرات كبيرة جدا أو صغيرة جدا.
سيكون تحرير الجينوم المباشر بوساطة كريسبر كاس9 باستخدام زيجوت قابلا للتطبيق لصنع فئران بسيطة بالضربة القاضية الجينية. يسهل بروتوكول استهداف الجينات ESC بوساطة كريسبر Cas9 إنتاج العديد من الفئران المعدلة وراثيا للتحليل المستقبلي في علوم الحياة.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لتطوير نماذج الفئران المعدلة وراثيًا باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية، خاصةً لتطبيقات إدخال الحمض النووي الكبيرة (KI). تستخدم الطريقة تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 لتعزيز كفاءة KI مقارنة بالطرق التقليدية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الهندسة الوراثية
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- تطوير نماذج الفئران
الخلفية
- الفئران المعدلة وراثيًا ضرورية لدراسة وظائف الجينات في الجسم الحي.
- أدت نماذج الحيوانات المعدلة وراثيًا إلى اكتشافات علمية مهمة.
- الطرق الفعالة لإدماج الحمض النووي ضرورية لتقدم البحث.
- لقد قامت تقنية CRISPR/Cas9 بإحداث ثورة في تقنيات التعديل الوراثي.
غرض الدراسة
- توفير بروتوكول موثوق لتكوين الفئران المعدلة وراثيًا.
- تحسين كفاءة إجراءات إدخال الحمض النووي الكبيرة.
- تسهيل البحث في العلوم الأساسية والتطبيقية.
الطرق المستخدمة
- تحضير الخلايا الليفية الجنينية للفئران (MEFs) والخلايا الجذعية الجنينية (ESCs).
- كهربائي الخليا الجذعية الجنينية مع خليط Cas9 RNP DNA.
- زراعة واختيار مستعمرات ESCs لتصنيفها الجينومي.
- استعادة الجنين وزراعته للزرع اللاحق.
النتائج الرئيسية
- يسمح البروتوكول بدمج فعال للتسلسلات الكبيرة للحمض النووي في الجينوم.
- يمكن زراعة الخلايا الجذعية الجنينية واختيارها بدون اختيار الدواء.
- تم إثبات التوليد الناجح للفئران المعدلة وراثيًا.
- يمكن تطبيق الطريقة في مجالات مختلفة، بما في ذلك العلوم الطبية وعلوم الحيوان.
الاستنتاجات
- يعزز هذا البروتوكول من كفاءة إنشاء نماذج الفئران المعدلة وراثيًا.
- تحسن تقنية CRISPR/Cas9 النتائج بشكل كبير مقارنة بالطرق التقليدية.
- النتائج لها آثار واسعة على البحث والتطبيقات الجينية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Efficient generation of gene-manipulated mouse models using CRISPR/Cas9-mediated targeting in embryonic stem cells (ESCs) addresses a critical bottleneck in preclinical research. This approach enables high-throughput, large DNA knock-in (KI) capabilities, supporting robust target validation and mechanistic de-risking for biopharma discovery pipelines. The method enhances predictive confidence and accelerates translational continuity across diverse genetic backgrounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of gene function through targeted large DNA KI in ESCs.
- Facilitates multi-allele and conditional allele generation for pathway clarification.
- Supports functional target validation and biological de-risking in disease-relevant models.
- Improves predictive confidence for portfolio triage and advancement decisions.
Screening & Assay Development
- Provides validated, genetically engineered ESCs for downstream phenotypic screening.
- Standardizes genetic backgrounds, enhancing assay reproducibility and quantitative outputs.
- Enables scalable production of diverse mouse models for reliable compound evaluation.
- Supports platform reuse for multiple gene targets and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered mouse models with translational biomarker strategies when relevant.
- Ensures continuity from genetic discovery through preclinical validation in vivo.
- Reduces risk in advancing candidates by enabling mechanistic studies in tailored models.
- Supports risk-adjusted decision-making for late-stage preclinical programs.
Pipeline & Workflow Integration
This CRISPR/Cas9 ESC targeting protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical model development, especially for complex genetic modifications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway analysis via efficient gene targeting.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined ESCs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables quantitative genotyping and sequence verification for robust model selection.
- Translational Research: Provides continuity for biomarker and mechanistic studies in engineered mouse models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for generating diverse genetically modified models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and streamlines large DNA KI workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient model generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ESC culture, CRISPR/Cas9 editing, and microinjection techniques.
- Demands access to specialized instrumentation for electroporation and embryo manipulation.
- Necessitates cross-team standardization for genotyping and colony selection protocols.
- Adaptable to various mouse strains, including those with challenging embryos.
- Efficiency may vary with DNA size and target locus, requiring empirical optimization.
