عزل ناقلات العلاج الجيني من الجيل التالي من خلال الهندسة والترميز الشريطي وفحص متغيرات قفيصة الفيروس المرتبط بالغدي (AAV)
أكتوبر 18, 2022
إنشاء مكتبة عرض الببتيد AAV والتحقق اللاحق من خلال الترميز الشريطي للمرشحين ذوي الخصائص الجديدة لإنشاء الجيل التالي من AAVs.
يسد هذا البروتوكول فجوة كبيرة بين التطور الطبيعي للفيروسات واستخدامها كناقلات مؤتلفة للعلاج الجيني البشري من خلال تمكين هندستها وتنويعها وتقسيمها إلى طبقات إلى طبقات. تسمح هذه التقنية بالفحص المتوازي عالي الإنتاجية للفيروس الغدي الجديد أو المعزول أو المصمم هندسيا ، باختصار AAV ، المتغيرات ، وبالتالي توفير أعداد الحيوانات والعمل والتكلفة والوقت. يمكن لمتغيرات قفيصة AVV المحددة أن تزيد من فعالية وخصوصية توصيل الجينات المحورة العلاجية القائمة على AAV ، وبالتالي تقليل الجرعة الفيروسية المطلوبة.
هذا يمكن أن يحسن سلامة وقابلية تطبيق العلاج الجيني. يمكن أيضا استخدام نفس النهج في هندسة القفيصة أو المروج لمركبات توصيل الجينات الأخرى التي تعمل على تحسين فهمنا لبيولوجيتها واستخدامها في العلاج الجيني. سيساعد في إثبات الإجراء طلاب الدكتوراه جوناس بيكر وجيشين ليو ، وما بعد الدكتوراه جوانا زومسكا ومارغريتا زاياس ، بالإضافة إلى مساعدي الأبحاث إيما غيرستمان وإلين ويدتكي من مختبري.
ابدأ بتحليل بيانات تسلسل NGS باستخدام Python 3 و Biopython. يتكون تحليل NGS من خطوتين. بالنسبة للخطوة الأولى، ابحث في ملفات التسلسل عن التسلسلات التي تفي بمعايير محددة مثل التسلسلات المرافقة والطول والموقع باستخدام البرنامج النصي الأول، وملف التكوين الذي يوفر المعلومات المطلوبة.
بالنسبة للخطوة الثانية ، قم بترجمة التسلسلات المستخرجة بدءا من تسلسل AGWGGC باستخدام البرنامج النصي رقم اثنين والتكوين و zuordnung. txt الذي يوفر المعلومات المطلوبة. قم بإعداد مجلدين: البرنامج النصي والبيانات.
انسخ ملفات Gzip المضغوطة الناتجة عن التسلسل إلى مجلد البيانات. ثم انسخ ملفات Python وملفات التكوين إلى مجلد البرنامج النصي كما هو موضح في المخطوطة النصية. قبل تشغيل البرامج النصية ، افتح zuordnung.
txt وإضافة عمودين منفصلين بعلامات جدولة. أدخل أسماء ملفات Gzip في العمود الأول والاسم النهائي المطلوب في العمود الثاني. قم بتغيير المتغيرات في ملف التكوين كما هو موضح في المخطوطة النصية.
باستخدام الأمر المحدد ، ابدأ اكتشاف تسلسل المتغير واستخراجه. سيكون الإخراج عبارة عن ملفات TXT مع تسلسلات الحمض النووي المستخرجة وأعداد قراءاتها. يحتوي رأس هذا الملف على بيانات إحصائية وسيتم نقل هذه البيانات إلى الملفات التالية.
ستكون بيانات TXT هذه هي ملف الإدخال للبرنامج النصي رقم اثنين حيث يتم ترجمة تسلسلات الحمض النووي وترتيبها وتحليلها. باستخدام الأمر المحدد ، ابدأ الترجمة الكهروضوئية وتحليل ملفات إخراج النص للنص الأول كما هو موضح في المخطوطة النصية. سيتم تسمية ملفات إخراج البرنامج النصي رقم اثنين باستخدام العمود الثاني من جدول البحث في zuordnung.
txt مع امتدادات بناء على نوع التحليل. تأكد من أن ملفات الإخراج الثلاثة تحتوي على بيانات إحصائية في الصفوف الأولى والعمود الأول مع فهرس كل تسلسل DNA من ملفات نص الإدخال. يجب أن تتكون الأعمدة المتبقية من تسلسل الحمض النووي ، وعدد القراءات ، والقراءة الأمامية أو العكسية ، وتسلسل الببتيد المترجم.
يجب أن تحتوي التسلسلات غير الصالحة على NA وغير صالحة في العمودين الأخيرين. تصور ملفات الإخراج باستخدام البرامج المتاحة بناء على احتياجات المستخدم. لإجراء تحليل بيانات تسلسل NGS باستخدام التعليمات البرمجية المخصصة في Python 3 ، يشتمل سير العمل على اكتشاف تسلسلات الباركود التي تسترشد بالتسلسلات المرافقة وطولها وموقعها ، بالإضافة إلى تحليل إثراء الباركود وتوزيعه على مجموعة الأنسجة.
قم بإعداد مجلدين: البرنامج النصي والبيانات. انسخ ملفات Gzip المضغوطة الناتجة عن التسلسل إلى مجلد البيانات. ثم انسخ ملفات python وملفات التكوين إلى مجلد البرنامج النصي كما هو موضح في المخطوطة النصية.
قبل تنفيذ البرنامج النصي ، قم بإنشاء ملفين نصيين محددين بعلامات جدولة:capsidvariance. txt مع تسلسلات الباركود المخصصة لأسماء متغيرات قفيصة AAV ، والتلوث. txt مع تسلسل الباركود التي تأتي من التلوث المحتمل.
أخيرا ، قم بتحرير ملف التكوين لتضمين معلومات المسار إلى المجلد مع بيانات التسلسل وتسلسل المناطق الجانبية للرموز الشريطية وموضعها وحجم النافذة لاكتشاف الباركود. قم بتنفيذ البرنامج النصي للكشف عن الباركود باستخدام المسارات وملفات التكوين المتوفرة باستخدام الأمر المعني. سيكون إخراج تنفيذ الأمر هذا عبارة عن ملفات TXT مع عمليات إعادة فرز لكل متغير capsid والعدد الإجمالي للقراءات المستردة من البيانات الأولية.
لتقييم توزيع قفيصة AAV الباركود بين الأنسجة أو الأعضاء ، في zuordnung. txt ، قم بتعيين اسم كل ملف نصي تم الحصول عليه من تشغيل الكشف عن الرمز الشريطي إلى اسم الأنسجة أو الأعضاء. أضف أسماء الملفات النصية في العمود الأول وأسماء الأنسجة أو الأعضاء المقابلة في التعيين المحدد بعلامة الجدولة.
إنشاء أعضاء. txt مع قائمة أسماء الأجهزة داخل وخارج الهدف ، والتي تتوافق مع الأسماء الواردة في المهمة zuordnung. ملف txt.
ثم قم بإنشاء normalization_organ. النص و normalization_variant. حددت علامة التبويب txt الملفات النصية ذات القيم الطبيعية لجميع متغيرات القفيصة وجميع الأعضاء والأنسجة.
في العمود الأول مع normalization_organ. txt ، اكتب الأسماء المعطاة لكل عضو ، والعمود الثاني مع قيم التطبيع للأنسجة المقابلة. املأ العمود الأول من normalization_variant.
txt مع قائمة أسماء capsid ، والعمود الثاني مع القيم الطبيعية لأعداد القراءة لكل capsid في المكتبة المجمعة. قم بتحرير ملف التكوين عن طريق تحديد المسارات الكاملة لجميع الملفات الإضافية وتنفيذ البرنامج النصي لتحليل الباركود باستخدام هذا الأمر المحدد. يقوم البرنامج النصي لتحليل الباركود بإخراج العديد من الملفات مثل الملفات النصية ذات التركيز النسبي أو قيم RC لتوزيع القفيصة داخل الأنسجة المختلفة بناء على خطوات التطبيع المتعددة الموضحة سابقا ، وملف جدول البيانات الذي يجمع بيانات الملف النصي في بيانات المصفوفة المدمجة.
تصور البيانات وإجراء تحليل عنقودي لبيانات المصفوفة كما هو موضح في المخطوطة النصية. سيقوم البرنامج النصي بإدخال التركيز النسبي. XLS وإنشاء قطعتين من خريطة الحرارة الهرمية وتحليل المكون الرئيسي.
لتعديل المؤامرات أو معلمات PNG ، افتح البرنامج النصي R واتبع الإرشادات الموجودة في قسم التعليقات. أظهرت المناطق الكمية لجين ممثل AAV2 أن 99.2٪ كانت إيجابية ل ITR ، مما يشير إلى أن قفيصات AAV تحتوي على الجينومات الفيروسية بأكملها. في جميع المجموعات الثلاث ، مثلت القراءات المستخرجة بناء على تسلسلات التوقيع الخاصة بالمكتبة حوالي 94٪ من إجمالي القراءات ، مما يشير إلى جودة جيدة.
من بين هؤلاء ، كان أكثر من 99٪ من قراءات PV صالحة وأكثر من 99٪ من قراءات PV الصالحة فريدة من نوعها ، مما يشير إلى أن المكتبة كانت متوازنة مع تنوع داخلي عال. يعكس الفرعان الرئيسيان للتسلسل الهرمي للخريطة الحرارية الاختلاف في كفاءة النقل لمتغيرات القفيصة. شمل الفرع الأيسر مع غالبية متغيرات القفيصة جميع القفيصات التي أظهرت قيمة تركيز نسبية عالية عبر معظم الأنسجة.
بصرف النظر عن خصوصية الكبد العالية بشكل لافت للنظر ، أظهرت ثلاثة قفيصات أخرى خصوصية في الحجاب الحاجز والعضلات الهيكلية والعضلة ذات الرأسين والدماغ. تضمن الفرع الأيمن من التجميع الهرمي متغيرات القفيصة ذات كفاءة النقل المنخفضة بشكل عام الأكثر وضوحا في الاثني عشر والبنكرياس. يشكل تحليل المكون الرئيسي للمجموعة الفرعية الأصلية مجموعة من متغيرات القفيصة ذات خصوصية الكبد العالية ويحدد الانتحاء العضلي المتميز VAR60.
عند محاولة هذا البروتوكول ، تحتاج إلى الانتباه إلى أخطاء الكتابة. يختلف بناء الجملة أيضا إذا كنت تستخدم موجه أوامر Windows مقارنة ب Linux. بعد تحديد متغيرات AAV الجديدة ، يجب التحقق من الإمكانات العلاجية والانتقالية في نموذج حيواني متوفى أو أكبر.
تتيح هذه التقنية مقارنة مباشرة جنبا إلى جنب لمتغيرات AAV في ظل ظروف متطابقة وهي متعددة الاستخدامات للغاية ، مما يمهد الطريق لترجمتها في الحيوانات الكبيرة ، أو حتى في البشر.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يتناول هذا البروتوكول الهندسة والتنويع للفيروسات الغدية المرتبطة (AAVs) لتطبيقات العلاج الجيني. إنه يتيح فحصًا واسع النطاق لمتغيرات AAV لتعزيز فعاليتها وخصوصيتها في توصيل الجينات العلاجية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- العلاج الجيني
- هندسة الناقلات الفيروسية
- الفيروسات الغدية المرتبطة
الخلفية
- تستخدم الفيروسات الغدية المرتبطة بشكل شائع كمتجهات هجينة للعلاج الجيني.
- هندسة الفيروسات الغدية المرتبطة يمكن أن تحسن قدراتها على التوصيل.
- يمكن أن يقلل الفحص واسع النطاق من استهلاك الموارد في البحث.
- فهم بيولوجيا AAV ضروري للتطبيقات العلاجية.
غرض الدراسة
- لتوليد مكتبة عرض الببتيد لـ AAVs.
- للتحقق من مرشحات AAV ذات الخصائص الجديدة.
- لتعزيز خصوصية وفعالية التوصيل الجيني المستند إلى AAV.
الطرق المستخدمة
- توليد مكتبات عرض الببتيد لـ AAV.
- ترميز مرشحات AAV للتعريف.
- تقنيات الفحص واسع النطاق.
- التعاون مع طلاب الدكتوراه ومساعدي البحث.
النتائج الرئيسية
- تحديد متغيرات غلاف AAV جديدة.
- تبين تحسين فعالية التوصيل.
- تقليل الجرعات الفيروسية المطلوبة للعلاج.
- تطبيقات محتملة لوسائل توصيل الجينات الأخرى.
الاستنتاجات
- يربط البروتوكول الفجوات في هندسة AAV للعلاج الجيني.
- يوفر إطارًا لتعزيز خصوصية الناقل الفيروسي.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى أنظمة توصيل الجينات الأخرى.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
High-throughput engineering, barcoding, and screening of AAV capsid variants enable rapid identification of gene therapy vectors with optimized tissue specificity and transduction efficiency. This approach streamlines early vector discovery, reduces animal usage, and accelerates the translation of next-generation gene delivery systems. The methodology supports portfolio-wide de-risking and prioritization of candidates for preclinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of AAV capsid diversity for functional target validation.
- Supports biological de-risking by clarifying tissue tropism and transduction profiles.
- Facilitates predictive confidence in vector selection for downstream development.
Screening & Assay Development
- Prepares barcoded AAV libraries for robust, parallel in vivo screening across multiple tissues.
- Standardizes quantitative readouts via NGS-based barcode analysis for reproducibility.
- Enables scalable, side-by-side evaluation of capsid variants under identical conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns vector selection with disease-relevant tissue targeting and translational biomarker needs.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct comparison in relevant models.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative tissue distribution data.
Pipeline & Workflow Integration
This methodology integrates from early discovery through lead identification and preclinical vector validation, providing a reusable platform for gene therapy vector optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of capsid function and tissue targeting via high-throughput screening.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative barcode-based outputs for robust variant comparison.
- Analytics: Provides statistical analysis of variant distribution, enrichment, and tissue specificity using NGS data.
- Translational Research: Enables alignment of vector properties with preclinical and disease-relevant endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a modular workflow adaptable to new capsid libraries and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vector selection.
- Operational Value: Standardizes and scales vector screening, reducing resource and animal use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by focusing on high-performing candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of gene therapy vectors.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, NGS library preparation, and bioinformatics analysis.
- Depends on access to sequencing infrastructure and computational resources for data processing.
- Demands rigorous cross-team standardization of barcode assignment and normalization protocols.
- Adaptable to various AAV libraries and tissue models with appropriate configuration.
- Attention to data integrity, file management, and error minimization is critical for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:16
Analysis of the AAV Viral Library (In Vitro) by NGS
3:42
Analysis of AAV Viral Library (In Vivo) by NGS
7:08
Results: Peptide Display AAV Capsid Engineering and Barcoded AAV Library Screening for Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors
8:36
Conclusion
