عزل ناقلات العلاج الجيني من الجيل التالي من خلال الهندسة والترميز الشريطي وفحص متغيرات قفيصة الفيروس المرتبط بالغدي (AAV)

يسد هذا البروتوكول فجوة كبيرة بين التطور الطبيعي للفيروسات واستخدامها كناقلات مؤتلفة للعلاج الجيني البشري من خلال تمكين هندستها وتنويعها وتقسيمها إلى طبقات إلى طبقات. تسمح هذه التقنية بالفحص المتوازي عالي الإنتاجية للفيروس الغدي الجديد أو المعزول أو المصمم هندسيا ، باختصار AAV ، المتغيرات ، وبالتالي توفير أعداد الحيوانات والعمل والتكلفة والوقت. يمكن لمتغيرات قفيصة AVV المحددة أن تزيد من فعالية وخصوصية توصيل الجينات المحورة العلاجية القائمة على AAV ، وبالتالي تقليل الجرعة الفيروسية المطلوبة.

هذا يمكن أن يحسن سلامة وقابلية تطبيق العلاج الجيني. يمكن أيضا استخدام نفس النهج في هندسة القفيصة أو المروج لمركبات توصيل الجينات الأخرى التي تعمل على تحسين فهمنا لبيولوجيتها واستخدامها في العلاج الجيني. سيساعد في إثبات الإجراء طلاب الدكتوراه جوناس بيكر وجيشين ليو ، وما بعد الدكتوراه جوانا زومسكا ومارغريتا زاياس ، بالإضافة إلى مساعدي الأبحاث إيما غيرستمان وإلين ويدتكي من مختبري.

ابدأ بتحليل بيانات تسلسل NGS باستخدام Python 3 و Biopython. يتكون تحليل NGS من خطوتين. بالنسبة للخطوة الأولى، ابحث في ملفات التسلسل عن التسلسلات التي تفي بمعايير محددة مثل التسلسلات المرافقة والطول والموقع باستخدام البرنامج النصي الأول، وملف التكوين الذي يوفر المعلومات المطلوبة.

بالنسبة للخطوة الثانية ، قم بترجمة التسلسلات المستخرجة بدءا من تسلسل AGWGGC باستخدام البرنامج النصي رقم اثنين والتكوين و zuordnung. txt الذي يوفر المعلومات المطلوبة. قم بإعداد مجلدين: البرنامج النصي والبيانات.

انسخ ملفات Gzip المضغوطة الناتجة عن التسلسل إلى مجلد البيانات. ثم انسخ ملفات Python وملفات التكوين إلى مجلد البرنامج النصي كما هو موضح في المخطوطة النصية. قبل تشغيل البرامج النصية ، افتح zuordnung.

txt وإضافة عمودين منفصلين بعلامات جدولة. أدخل أسماء ملفات Gzip في العمود الأول والاسم النهائي المطلوب في العمود الثاني. قم بتغيير المتغيرات في ملف التكوين كما هو موضح في المخطوطة النصية.

باستخدام الأمر المحدد ، ابدأ اكتشاف تسلسل المتغير واستخراجه. سيكون الإخراج عبارة عن ملفات TXT مع تسلسلات الحمض النووي المستخرجة وأعداد قراءاتها. يحتوي رأس هذا الملف على بيانات إحصائية وسيتم نقل هذه البيانات إلى الملفات التالية.

ستكون بيانات TXT هذه هي ملف الإدخال للبرنامج النصي رقم اثنين حيث يتم ترجمة تسلسلات الحمض النووي وترتيبها وتحليلها. باستخدام الأمر المحدد ، ابدأ الترجمة الكهروضوئية وتحليل ملفات إخراج النص للنص الأول كما هو موضح في المخطوطة النصية. سيتم تسمية ملفات إخراج البرنامج النصي رقم اثنين باستخدام العمود الثاني من جدول البحث في zuordnung.

txt مع امتدادات بناء على نوع التحليل. تأكد من أن ملفات الإخراج الثلاثة تحتوي على بيانات إحصائية في الصفوف الأولى والعمود الأول مع فهرس كل تسلسل DNA من ملفات نص الإدخال. يجب أن تتكون الأعمدة المتبقية من تسلسل الحمض النووي ، وعدد القراءات ، والقراءة الأمامية أو العكسية ، وتسلسل الببتيد المترجم.

يجب أن تحتوي التسلسلات غير الصالحة على NA وغير صالحة في العمودين الأخيرين. تصور ملفات الإخراج باستخدام البرامج المتاحة بناء على احتياجات المستخدم. لإجراء تحليل بيانات تسلسل NGS باستخدام التعليمات البرمجية المخصصة في Python 3 ، يشتمل سير العمل على اكتشاف تسلسلات الباركود التي تسترشد بالتسلسلات المرافقة وطولها وموقعها ، بالإضافة إلى تحليل إثراء الباركود وتوزيعه على مجموعة الأنسجة.

قم بإعداد مجلدين: البرنامج النصي والبيانات. انسخ ملفات Gzip المضغوطة الناتجة عن التسلسل إلى مجلد البيانات. ثم انسخ ملفات python وملفات التكوين إلى مجلد البرنامج النصي كما هو موضح في المخطوطة النصية.

قبل تنفيذ البرنامج النصي ، قم بإنشاء ملفين نصيين محددين بعلامات جدولة:capsidvariance. txt مع تسلسلات الباركود المخصصة لأسماء متغيرات قفيصة AAV ، والتلوث. txt مع تسلسل الباركود التي تأتي من التلوث المحتمل.

أخيرا ، قم بتحرير ملف التكوين لتضمين معلومات المسار إلى المجلد مع بيانات التسلسل وتسلسل المناطق الجانبية للرموز الشريطية وموضعها وحجم النافذة لاكتشاف الباركود. قم بتنفيذ البرنامج النصي للكشف عن الباركود باستخدام المسارات وملفات التكوين المتوفرة باستخدام الأمر المعني. سيكون إخراج تنفيذ الأمر هذا عبارة عن ملفات TXT مع عمليات إعادة فرز لكل متغير capsid والعدد الإجمالي للقراءات المستردة من البيانات الأولية.

لتقييم توزيع قفيصة AAV الباركود بين الأنسجة أو الأعضاء ، في zuordnung. txt ، قم بتعيين اسم كل ملف نصي تم الحصول عليه من تشغيل الكشف عن الرمز الشريطي إلى اسم الأنسجة أو الأعضاء. أضف أسماء الملفات النصية في العمود الأول وأسماء الأنسجة أو الأعضاء المقابلة في التعيين المحدد بعلامة الجدولة.

إنشاء أعضاء. txt مع قائمة أسماء الأجهزة داخل وخارج الهدف ، والتي تتوافق مع الأسماء الواردة في المهمة zuordnung. ملف txt.

ثم قم بإنشاء normalization_organ. النص و normalization_variant. حددت علامة التبويب txt الملفات النصية ذات القيم الطبيعية لجميع متغيرات القفيصة وجميع الأعضاء والأنسجة.

في العمود الأول مع normalization_organ. txt ، اكتب الأسماء المعطاة لكل عضو ، والعمود الثاني مع قيم التطبيع للأنسجة المقابلة. املأ العمود الأول من normalization_variant.

txt مع قائمة أسماء capsid ، والعمود الثاني مع القيم الطبيعية لأعداد القراءة لكل capsid في المكتبة المجمعة. قم بتحرير ملف التكوين عن طريق تحديد المسارات الكاملة لجميع الملفات الإضافية وتنفيذ البرنامج النصي لتحليل الباركود باستخدام هذا الأمر المحدد. يقوم البرنامج النصي لتحليل الباركود بإخراج العديد من الملفات مثل الملفات النصية ذات التركيز النسبي أو قيم RC لتوزيع القفيصة داخل الأنسجة المختلفة بناء على خطوات التطبيع المتعددة الموضحة سابقا ، وملف جدول البيانات الذي يجمع بيانات الملف النصي في بيانات المصفوفة المدمجة.

تصور البيانات وإجراء تحليل عنقودي لبيانات المصفوفة كما هو موضح في المخطوطة النصية. سيقوم البرنامج النصي بإدخال التركيز النسبي. XLS وإنشاء قطعتين من خريطة الحرارة الهرمية وتحليل المكون الرئيسي.

لتعديل المؤامرات أو معلمات PNG ، افتح البرنامج النصي R واتبع الإرشادات الموجودة في قسم التعليقات. أظهرت المناطق الكمية لجين ممثل AAV2 أن 99.2٪ كانت إيجابية ل ITR ، مما يشير إلى أن قفيصات AAV تحتوي على الجينومات الفيروسية بأكملها. في جميع المجموعات الثلاث ، مثلت القراءات المستخرجة بناء على تسلسلات التوقيع الخاصة بالمكتبة حوالي 94٪ من إجمالي القراءات ، مما يشير إلى جودة جيدة.

من بين هؤلاء ، كان أكثر من 99٪ من قراءات PV صالحة وأكثر من 99٪ من قراءات PV الصالحة فريدة من نوعها ، مما يشير إلى أن المكتبة كانت متوازنة مع تنوع داخلي عال. يعكس الفرعان الرئيسيان للتسلسل الهرمي للخريطة الحرارية الاختلاف في كفاءة النقل لمتغيرات القفيصة. شمل الفرع الأيسر مع غالبية متغيرات القفيصة جميع القفيصات التي أظهرت قيمة تركيز نسبية عالية عبر معظم الأنسجة.

بصرف النظر عن خصوصية الكبد العالية بشكل لافت للنظر ، أظهرت ثلاثة قفيصات أخرى خصوصية في الحجاب الحاجز والعضلات الهيكلية والعضلة ذات الرأسين والدماغ. تضمن الفرع الأيمن من التجميع الهرمي متغيرات القفيصة ذات كفاءة النقل المنخفضة بشكل عام الأكثر وضوحا في الاثني عشر والبنكرياس. يشكل تحليل المكون الرئيسي للمجموعة الفرعية الأصلية مجموعة من متغيرات القفيصة ذات خصوصية الكبد العالية ويحدد الانتحاء العضلي المتميز VAR60.

عند محاولة هذا البروتوكول ، تحتاج إلى الانتباه إلى أخطاء الكتابة. يختلف بناء الجملة أيضا إذا كنت تستخدم موجه أوامر Windows مقارنة ب Linux. بعد تحديد متغيرات AAV الجديدة ، يجب التحقق من الإمكانات العلاجية والانتقالية في نموذج حيواني متوفى أو أكبر.

تتيح هذه التقنية مقارنة مباشرة جنبا إلى جنب لمتغيرات AAV في ظل ظروف متطابقة وهي متعددة الاستخدامات للغاية ، مما يمهد الطريق لترجمتها في الحيوانات الكبيرة ، أو حتى في البشر.