تتبع الاتجار بالخلايا التائية المستحثة بالأجسام المضادة ثنائية النوع باستخدام الخلايا التائية البشرية المستحثة باللوسيفيراز

تتيح هذه الطريقة للمستخدمين تتبع الخلايا التائية بسهولة في الجسم الحي لتقييم حركية صاروخ موجه ومراقبة استمرار الخلايا التائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تكرارها في نقاط زمنية متعددة على نفس الحيوان دون الحاجة إلى التضحية في قياس التدفق الخلوي أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية. يمكن تعديل هذه التقنية لتتبع أنواع أخرى من الخلايا المناعية أيضا.

لزراعة 293 خلية تائية ، قم بإعداد لتر واحد من DMEM بإضافة 110 ملليلتر من مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة و 11 ملليلتر من البنسلين الستربتومايسين. قم بإذابة الجليد خمس مرات 10 إلى الخلايا 293T السادسة وانقلها إلى دورق T175 يحتوي على DMEM. قسم الخلايا من واحد إلى 10 كل ثلاثة أيام لمدة ستة أيام قبل أن تصبح الخلايا متقاربة بنسبة تزيد عن 90٪.

للنقل ، انقل 1.5 ملليلتر من الوسائط إلى أنبوبين سعة 50 ملليلتر باستخدام ماصة. إلى أنبوب واحد ، أضف 10 ميكروغرام من بلازميد VSVG ، و 20 ميكروغرام من gag pol ، و 20 ميكروغرام من خنفساء النقر الحمراء TDtomato أو CBRTDR luciferase plasmid واخلطها. أضف 100 ميكرولتر من الحمض النووي في كاشف نقل المختبر إلى أنبوب آخر واخلطه.

احتضان كلا الأنبوبين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. انقل الوسائط التي تحتوي على كاشف نقل الحمض النووي في المختبر بالتنقيط إلى الأنبوب الذي يحتوي على بلازميدات الحمض النووي واخلطها برفق مع ماصة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

أثناء الحضانة ، افصل الخلايا التائية 293 بإضافة خمسة إلى 10 ملليلتر من 0.05٪ تربسين. بمجرد انفصال الخلايا ، أضف 10 ملليلتر من الوسائط وأجهزة الطرد المركزي عند 800 جرام لمدة خمس دقائق. إعادة تعليق الخلايا في 1.5 ملليلتر من الوسائط.

أضف الوسائط التي تحتوي على كاشف نقل الحمض النووي في المختبر وبلازميدات الحمض النووي إلى الخلايا التائية 293 واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، انقل التعليق إلى قارورة T175. أضف 18 ملليلتر من الوسائط واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، استنشق الوسائط بعناية باستخدام ماصة زجاجية دون فصل الخلايا واستبدالها ب 18 مل من الوسائط الطازجة. مرة أخرى ، احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة المادة الطافية الفيروسية باستخدام ماصة موضوعة على الثلج وأجهزة الطرد المركزي عند 800 جرام لمدة خمس دقائق لتكوير الخلايا والحطام.

قم بتصفية المادة الطافية الفيروسية باستخدام مرشح 0.22 ميكرون وضعها على الفور على الجليد. للتنشيط في المختبر للخلايا التائية البشرية ، أضف 10 ملليلتر من PBS يحتوي على 0.1٪ من ألبومين مصل الأبقار أو BSA واثنين من المليمولار EDTA إلى أنبوب معقم سعة 15 ملليلتر. ثم لغسل الخرز ، أضف الخرز في أنبوب وضع الأنبوب في رف مغناطيسي.

بعد دقيقتين ، قم بإزالة PBS من الأنبوب. بعد تحضير DMEM ، أضف الخرزات المغسولة و interleukin-2 أو IL-2 إلى تركيز نهائي يبلغ 30 وحدة دولية لكل ملليلتر. عد الخلايا التائية باستخدام مقياس خلوي دموي وصبغة تريبان الزرقاء.

بعد العد ، أضف العدد المطلوب من الخلايا التائية إلى الوسائط واقلب الأنبوب برفق للخلط. لوحة 2.5 ملليلتر من الوسائط التي تحتوي على مليوني خلية تائية وخرز و IL-2 في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. الثقافة عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون المرطب.

افحص الخلايا التائية تحت هدف 20X كل يوم لمدة ثلاثة أيام لتحديد وقت التحويل باستخدام لوسيفيراز. بعد ذلك ، لتحضير صفيحة RetroNectin ، أضف ملليلتر من 20 ميكروغرام لكل مليلتر RetroNectin في PBS إلى بئر من صفيحة ستة آبار غير معالجة واحتضانها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. نضح RetroNectin دون خدش الجزء السفلي من اللوحة وإضافة ثلاثة ملليلتر من 2٪ BSA في PBS لكل بئر في لوحة ستة آبار.

احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، من أجل التنظير ، قم باستنشاق BSA وغسل الآبار مرة واحدة بثلاثة ملليلتر من PBS. استمر أو استبدل ب PBS جديد واترك اللوحة مغطاة عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، أضف ملليلتر من طاف الفيروس CBRTDR luciferase لكل بئر وأجهزة الطرد المركزي عند 1،240 جم لمدة 90 دقيقة عند 32 درجة مئوية. للتحويل ، بعد عد الخلايا التائية ، قم باستنشاق المادة الطافية الفيروسية ولوحة مليوني خلية تائية لكل بئر في ستة ملليلتر من DMEM تحتوي على 30 وحدة دولية لكل ملليلتر من IL-2 البشري. افحص الخلايا التائية لمدة يومين.

عندما تكون الخلايا متقاربة تقريبا ، اغسلها برفق من قاع اللوحة باستخدام ماصة وانقل كل بئر إلى قارورة T75 منفصلة. أضف تسعة ملليلتر من الوسائط ليصبح إجمالي حجمها 15 ملليلتر لكل دورق. في اليوم التالي ، أضف 15 ملليلتر من الوسائط وتأكد من نجاح التحويل عن طريق إجراء قياس التدفق الخلوي.

بعد تخدير الفأر ، باستخدام إبرة قياس 26 ، حقن 20 مليون خلية تائية في 100 ميكرولتر من الوسائط بشكل رجعي. إدارة 1،000 وحدة من IL-2 المؤتلف تحت الجلد لدعم بقاء الخلايا التائية في الجسم الحي. ثم إدارة الجسم المضاد ثنائي النوع بأثر رجعي أو داخل الصفاق.

للتصوير في الجسم الحي ، قم بتطبيق 100 ميكرولتر من ثلاثة ملليغرام من D-luciferin عن طريق الحقن خلف الحجاج بإبرة قياس 26 في فأر مخدر. لالتقاط الصور، ضع الماوس في الحجرة الضيقة للضوء في جهاز التصوير بحيث يكون الجناح الذي يحمل الطعم الأجنبي متجها لأعلى نحو الكاميرا. باستخدام لوحة التحكم في الاكتساب، حدد الإنارة والصور الفوتوغرافية والتراكب.

اضبط وقت التعرض على تلقائي ، والتجميع على متوسط ، و f-stop على واحد والتقاط الصور. بعد الصورة الأولى، اضبط وقت التعريض الضوئي ليطابق ذلك المحسوب تلقائيا للصورة الأولى بحيث يمكن مقارنة الصور اللاحقة مباشرة. التقط مجموعة أخرى من الصور باستخدام مستلق الفأر لتقييم وجود الخلايا التائية في الرئتين.

تنتقل الخلايا التائية المسلحة إلى الورم بشكل أسرع من الخلايا التائية غير المسلحة ، تاركة الرئتين قبل يومين. تم قياس كمية تسلل الخلايا التائية إلى الأورام بمرور الوقت عن طريق التلألؤ الحيوي وتم التعبير عنها كقطعان إجمالية أو إشعاع لكل بكسل مدمج على محيط الورم. يمكن مراقبة الاتجار بالخلايا التائية لمدة 28 يوما بعد حقن الخلايا التائية المتحولة إلى لوسيفيراز ، مما يسمح بتتبع توجيه الخلايا التائية واستمرارها طوال فترة العلاج.

يظهر الاتجار بالخلايا التائية في الطعوم الخارجية المشتقة من مريض سرطان الثدي البشري الإيجابي HER2 في فئران DKO. لم يكن للعلاج بالجسم المضاد ثنائي النوع HER2 مع FC غير الصامت أي تأثير على نمو الورم مقارنة بالجسم المضاد ثنائي النوع. في المقابل ، كان العلاج بالجسم المضاد ثنائي النوع HER2 الذي يحتوي على طفرة N297A بمفرده أو بالاشتراك مع طفرة K322A قادرا على إيقاف نمو الورم تماما.

بالنسبة للمجموعات التي تعاني من طفرات إسكات ، وصلت إشارة تلألؤ الخلايا التائية إلى ذروة أعلى في اليوم الثالث بعد الحقن واستمرت عند مستوى أعلى مقارنة بالجسم المضاد ثنائي النوع الذي يتم التحكم فيه والجسم المضاد ثنائي النوع HER2 غير الصامت. أظهرت الفئران التي تحمل الورم الأرومي العصبي المشتق من المريض أن استنفاد البلاعم الإيجابية Ly6C زاد بشكل كبير من توجيه الخلايا التائية إلى الأورام ، مما أدى إلى انخفاض نمو الورم والبقاء على قيد الحياة لفترة طويلة. كان التأثير أكثر وضوحا في الطعوم الخارجية المشتقة من مرضى الساركوما العظمية.

من بين الأجسام المضادة ثنائية النوع التي تستهدف مستضد الورم STEAP1 ، أدى تنسيق IGGL SCFV إلى تسلل أكبر بكثير للخلايا التائية في اليوم السادس بعد الجرعة الأولى من الخلايا التائية التي استمرت طوال مدة العلاج. لم يتم التنبؤ بمثل هذه الملاحظات من خلال مقايسات السمية الخلوية في المختبر. بعد تتبع الخلايا التائية في الجسم الحي ، لا يزال بإمكان المستخدمين إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتحديد مكان وجود الخلايا التائية داخل الورم أو الأنسجة الطبيعية الأخرى بشكل أكثر تحديدا.