توصيف سلالة الإشريكية القولونية المسببة للأمراض المشتقة من مزارع Oreochromis spp. باستخدام تسلسل الجينوم الكامل
ديسمبر 23, 2022
أدت جدوى استراتيجيات تسلسل الجينوم الكامل (WGS) باستخدام أدوات الطاولة إلى تبسيط استجواب الجينوم لكل ميكروب ذي صلة بالصحة العامة في بيئة معملية. يتم وصف التكيف المنهجي لسير العمل ل WGS البكتيرية كما يتم تقديم خط أنابيب المعلوماتية الحيوية للتحليل.
يمكن أن يساعد تسلسل الجينوم الكامل ، WGS ، في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مقاومة مضادات الميكروبات من خلال استجواب الجينوم وتحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء النمط الظاهري لمقاومة مضادات الميكروبات. يحسن تسلسل الجينوم العالمي استكشاف الحمض النووي ، الحمض النووي البكتيري على نطاق واسع ، مما يسهل التوصيف المتعمق للميكروبات في جولة واحدة بما في ذلك المتغيرات المسببة للأمراض ذات الصلة الوثيقة. يوفر تسلسل الجيل التالي التعرف السريع على الكائنات الحية الدقيقة وتوصيفها وخصائصها المقاومة لمضادات الميكروبات مع الأخذ في الاعتبار أداة للتشخيص والعلاج والترصد وتتبع مصدر مسببات الأمراض في السياق السريري.
يمكن أن تلعب منهجيات تسلسل الجيل التالي دورا حاسما في مراقبة مسببات الأمراض وتتبع مصادرها ليس فقط في السياق السريري ولكن أيضا في البيئات البيئية والأهم من ذلك في سلامة الأغذية. حاليا ، هذه ليست تقنية روتينية. في الواقع ، فإن القليل من الإجراء سيجعل من السهل فهم مدى نجاحهم في إجراء التجربة.
ستوضح الإجراء جوليسا إنسيسو إيبارا ، فني الجينوم في مجموعة العمل الخاصة بنا. بعد استخراج وقياس الحمض النووي البكتيري ، أضف 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعلامات. اثنين ميكرولتر من المدخلات G D N A في أنبوب 0.2 ملليلتر وتخلط عن طريق ماصة ماص.
أضف ميكرولترا واحدا من المخزن المؤقت للتضخيم والماصة لأعلى ولأسفل للخلط. ثم قم بتدوير الأنبوب لأسفل عند 280 جم لمدة دقيقة واحدة. ضع العينات في دراجة حرارية عند 55 درجة سلزية لمدة خمس دقائق ، تليها الاحتفاظ عند 10 درجات مئوية.
أضف ميكرولترا واحدا من المخزن المؤقت المعادل إلى أنابيب العينة واخلطه برفق عن طريق السحب. قم بتدوير الأنبوب واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 1.7 ميكرولتر من كل محول فهرس وثلاثة ميكرولتر من مزيج PCR الرئيسي للفهرسة.
بعد خلط المكونات ، قم بتدويرها عند 280 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ضع العينات في العجلة الحرارية وقم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني كما هو موضح في المخطوطة. الآن خلط حل حبة مغناطيسية تجارية عن طريق دوامة.
وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. انقل عينة G D N A الموسومة أو المفهرسة إلى عينة جديدة أنبوب سعة خمسة ملليلتر وأضف 0.6 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لكل ميكرولتر من الحجم النهائي لعينة G D N A. امزج المكونات برفق عن طريق السحب واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ضع أنابيب العينة على رف مغناطيسي لمدة دقيقتين حتى يتم مسح المادة الطافية. تخلص من المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخرز. ثم أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ دون خلط.
احتضان لمدة 30 ثانية حتى يمسح eluit وإزالة الطاف بعناية دون إزعاج الخرز. كرر هذا الإجراء وجفف الخرز في الهواء لمدة 10 دقائق. أضف الآن 15 ميكرولترا من 10 ملليمولار تريس عازلة إلى الخرز الممزوج بلطف عن طريق السحب واحتضانه لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
ضع أنابيب العينة على الرف المغناطيسي لمدة دقيقتين للسماح للطافي بالمسح. بعد ذلك ، انقل بعناية 14 ميكرولترا من المادة الطافية من أنبوب العينة إلى أنبوب جديد سعة 0.2 ملليلتر واحصل على المكتبة التي تم تنظيفها. قم بإذابة خرطوشة الكاشف باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
اسحب خمسة ميكرولتر من المكتبة الطبيعية إلى أنبوب منخفض ، 1.5 ملليلتر وقم بتخفيف المكتبة المجمعة عند أربعة نانومولار بالحجم المناسب من RSB. ثم أضف خمسة ميكرولتر لكل من المكتبة المجمعة و 0.2 هيدروكسيد الصوديوم العادي في رابط منخفض جديد ، أنبوب 1.5 ملليلتر. لتشويه المكتبة المجمعة إلى خيوط فردية ، امزج الأنبوب عن طريق الدوامة.
تدور لمدة دقيقة واحدة واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف الآن 10 ميكرولتر من المكتبة المجمعة المشوهة 990 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين المبرد مسبقا واخلطها برفق عن طريق سحب العينات. ضع الأنبوب على الثلج حتى يتم إجراء التخفيف النهائي لتحميل جهاز التسلسل.
صب وإعداد مكتبة تحكم بتركيز أربعة نانومولار عن طريق خلط اثنين ميكرولتر من مكتبة التحكم وثلاثة ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. ثم أضف خمسة ميكرولتر لكل من مكتبة التحكم وأعدت طازجة 0.2 هيدروكسيد الصوديوم العادي. تحويل مكتبة التحكم إلى خيوط مفردة كما هو موضح سابقا.
امزج برفق 10 ميكرولتر من مكتبة التحكم المشوهة و 990 ميكرولتر من مخزن التهجين المبرد مسبقا عن طريق السحب ، وضعه على الثلج حتى يتم التخفيف النهائي لتحميل جهاز التسلسل. في ربط منخفض جديد ، أنبوب 1.5 ملليلتر ، اجمع 594 ميكرولتر من المكتبة المجمعة المشوهة وستة ميكرولتر من مكتبة التحكم المشوهة. امزج بشكل صحيح وقم بتخفيف مزيج المكتبة النهائي إلى تركيز تحميل نهائي يبلغ 1.2 بيكو مولار بحجم 600 ميكرولتر باستخدام مخزن التهجين المبرد مسبقا.
قبل تحميل مزيج المكتبة النهائي على خرطوشة الكاشف ، قم بإجراء معالجة حرارية إضافية لتحقيق تحميل فعال في خلية التدفق. احتضان مزيج المكتبة النهائي لمدة دقيقتين عند 96 درجة مئوية. اقلب الأنبوب لخلطه وضع الأنبوب على الثلج لمدة خمس دقائق.
قم بتحميل 500 ميكرولتر من مزيج المكتبة النهائي في خزان التصميم على خرطوشة الكاشف. بعد بدء جهاز التسلسل ، قم بتحميل خرطوشة الكاشف وخلية التدفق وإعداد تشغيل التسلسل. لتحليل البيانات ، اتصل بخادم بيانات التسلسل وقم بتنزيل ملفات FASTQ.
قم بتقييم الجودة الأولية لبيانات التسلسل الأولية باستخدام برنامج تابع لجهة خارجية. قم بإزالة تسلسلات المحول المتبقية والقواعد منخفضة الجودة والقراءات القصيرة من بيانات التسلسل الأولية. قم بتجميع بيانات تسلسل فحص الجودة في مستوى contig أو سقالة باستخدام برنامج تابع لجهة خارجية.
قم بإجراء تعليق توضيحي للجينوم عن طريق إرسال ملف Phaster الذي يحتوي على الجينوم المجمع إلى خادم RAST. قم بتحميل ملف Phaster إلى مركز علم الأوبئة الجينوم ومنصات الويب لكتابة كليرمونت لتحديد السمات الوبائية. ARGS ، VAGS والبلازميدات.
قم بتحميل ملف Phaster إلى خادم Phaster لتحديد تسلسلات البروفاج. كشف شرح الجينوم عن 5،633 سمة مشفرة منها 5،524 جينات طلاء البروتين و 109 تسلسلات مرتبطة بالحمض النووي الريبي. تنتمي سلالة الإشريكية القولونية المتوقعة إلى مجموعة فيلو B الأولى ونوع التسلسل 40.
تم تحديد محدد لمقاومة مضادات الميكروبات ، وهو ترميز جين M D F A لمضخة تدفق متعددة الأدوية واسعة الطيف. كما تم تحديد الجينات المشفرة للسموم المعوية المستقرة للحرارة وبروتين مقاومة المصل ونظام الإفراز من النوع الثالث جنبا إلى جنب مع بروتينات المستجيب المفرز. يتم تجميع تسلسلات الترميز في مجموعات من البروتينات ذات الصلة وظيفيا تسمى الأنظمة الفرعية خاصة تلك التي تلعب أدوارا وظيفية في الكربوهيدرات والبروتينات والأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي المشتق ونقل الغشاء.
الممارسة المعملية الجيدة أساسية من خلال جميع البروتوكولات. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر بشكل خاص عند معالجة عينات متعددة أثناء إعداد مكتبة الحمض النووي المقطعية لتجنب التلوث المتبادل.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة جدوى استراتيجيات تسلسل الجينوم الكامل (WGS) باستخدام أجهزة سطح المكتب لاستجواب الجينوم الميكروبي. وتسلط الضوء على أهمية WGS في فهم المقاومة للمضادات الحيوية وتقدم خط أنابيب المعلوماتية الحيوية للتحليل.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الجينوم الميكروبي
- المقاومة للمضادات الحيوية
- المعلوماتية الحيوية
الخلفية
- يساعد تسلسل الجينوم الكامل (WGS) في استكشاف الحمض النووي البكتيري.
- يسهل توصيف المتغيرات المسببة للأمراض الوثيقة الصلة.
- التسلسل من الجيل التالي ضروري لتحديد الكائنات الدقيقة بسرعة.
- WGS ليس بعد تقنية روتينية في البيئات السريرية.
هدف الدراسة
- لتكييف سير عمل WGS للتحليل البكتيري.
- لتقديم خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحليل الجينوم الميكروبي.
- لاستكشاف دور WGS في أبحاث المقاومة للمضادات الحيوية.
الطرق المستخدمة
- استراتيجيات تسلسل الجينوم الكامل على سطح المكتب.
- تطوير خط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية.
- توصيف الجينومات الميكروبية.
- تقييم ملفات تعريف المقاومة للمضادات الحيوية.
النتائج الرئيسية
- التكيّف الناجح لمنهجيات WGS للاستخدام المختبري.
- تطوير خط أنابيب معلوماتية حيوية شامل.
- تعزيز فهم آليات المقاومة للمضادات الحيوية.
- تطبيقات محتملة في التشخيص السريري وسلامة الأغذية.
الاستنتاجات
- WGS هو أداة قوية لاستجواب الجينوم الميكروبي.
- يلعب دورًا مهمًا في فهم المقاومة للمضادات الحيوية.
- يلزم المزيد من التكامل لـ WGS في الممارسة الروتينية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Whole-genome sequencing (WGS) enables comprehensive genomic profiling of pathogenic and antimicrobial-resistant microbes from aquaculture, directly informing risk assessment and surveillance strategies in food safety and environmental health. Integrating WGS into early discovery pipelines enhances predictive confidence in identifying virulence and resistance determinants, supporting portfolio decisions for translational research and public health interventions. This approach strengthens enterprise capabilities for rapid response to emerging microbial threats in the food supply chain.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables genome-wide interrogation of resistance and virulence mechanisms in environmental isolates.
- Supports functional target validation by identifying key genetic determinants relevant to pathogenicity.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the molecular basis of antimicrobial resistance.
- Improves predictive confidence for prioritizing microbial targets in surveillance and intervention programs.
Screening & Assay Development
- Provides validated genomic data for developing molecular assays targeting resistance and virulence genes.
- Enables standardization of detection workflows for high-throughput screening of environmental and foodborne pathogens.
- Delivers quantitative outputs for benchmarking assay sensitivity and specificity.
- Supports scalable screening platforms for ongoing monitoring of microbial threats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genomic findings with translational biomarker discovery for food safety and public health applications.
- Ensures continuity from environmental surveillance to preclinical risk assessment of microbial contaminants.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for intervention strategies targeting high-risk strains.
- Provides mechanistic insights to guide translational research on antimicrobial resistance dissemination.
Pipeline & Workflow Integration
WGS-based characterization integrates into the discovery-to-surveillance continuum, bridging early detection, target validation, and translational risk assessment for environmental and foodborne pathogens.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on resistance and virulence gene prevalence in aquaculture-derived microbes.
- Screening: Supplies genomic benchmarks for assay development and validation in environmental monitoring workflows.
- Analytics: Delivers quantitative genomic outputs for comparative analysis of microbial strains and resistance profiles.
- Translational Research: Connects environmental genomics to preclinical evaluation of food safety risks.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genomic surveillance capability for ongoing risk management.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in identifying and tracking antimicrobial resistance and virulence factors.
- Operational Value: Standardizes genomic workflows for reproducible and scalable pathogen characterization.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making for intervention and surveillance investments.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of microbial threats in food safety and public health portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genomics, bioinformatics, and microbial ecology for data interpretation.
- Demands access to benchtop sequencers and robust computational infrastructure for data processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and library preparation to prevent contamination.
- Must adapt workflows for diverse environmental and foodborne microbial samples.
- Dependent on quality control and data validation steps to ensure actionable outputs.
