Name: نمذجة تطور المخيخ البشري في المختبر في هيكل 2D (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: اكتشف نمذجة تطور المخيخ البشري في المختبر باستخدام خلايا جذعية متعددة القدرات المستحثة. يتيح هذا النهج دراسة آليات التطور العصبي المبكر والاضطرابات النفسية العصبية ذات الصلة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر جيني غرينغر ريتشاردز على عملها الشامل في التحقق من صحة موضوعات التحكم لدينا ، والتي أنشأنا منها iPSCs للتحكم. تم دعم هذا العمل من قبل NIH T32 MH019113 (إلى D.A.M. و K.A.K.) ، و Nellie Ball Trust (إلى T.H.W. و A.J.W.) ، NIH R01 MH111578 (إلى V.A.M. و J.A.W.) ، NIH KL2 TR002536 (إلى A.J.W.) ، وصندوق Roy J. Carver الخيري (إلى V.A.M. ، J.A.W. ، و A.J.W.). تم إنشاء الأرقام مع BioRender.com.

<ol><li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).</li>
<li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).</li>
<li>Muguruma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+for+self-formation+of+the+cerebellum+from+human+pluripotent+stem+cells+through+induction+of+the+isthmic+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer.</a> Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li>
<li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+3D+cerebellar+differentiation+protocol+with+optional+2D+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888(2017).</li>
<li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).</li>
<li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70(2020).</li>
<li>Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+transcriptional+landscape+of+xeno-free+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids.</a> Scientific Reports. 11, 12959(2021).</li>
<li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).</li>
<li>Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+passaging+of+adherent+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 9 (1), 88012(2014).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).</li>
<li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).</li>
<li>Hoshino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a%2C+a+bHLH+transcriptional+gene%2C+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).</li>
<li>Mizuhara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cells+originate+from+cerebellar+ventricular+zone+progenitors+positive+for+Neph3+and+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin.</a> Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).</li>
<li>Ferreira, A., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Class+III+%CE%B2-tubulin+isotype+in+developing+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).</li>
<li>Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+conserved+isotype-defining+variable+region+sequences+for+four+vertebrate+beta+tubulin+polypeptide+classes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).</li>
<li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed%2C+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain-hindbrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development.</a> Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).</li>
<li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otx2%2C+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).</li>
<li>Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+transcriptional+corepressor%2C+Corl2%2C+as+a+cerebellar+Purkinje+cell-selective+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker.</a> Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).</li>
<li>Aldinger, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+cell+type+transcriptional+landscape+of+human+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development.</a> Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).</li>
<li>Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+usage+of+Otx2+promoters+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development.</a> Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).</li>
<li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PsychENCODE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li>
<li>Aijaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+SIX3+and+SIX6+in+human+tissues+reveals+differences+in+expression+and+a+novel+correlation+between+the+expression+of+SIX3+and+the+genes+encoding+isocitrate+dehyhrogenase+and+cadherin+18%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18.</a> Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).</li>
<li>Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+Six3+and+Six6+distribution+in+the+developing+and+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain.</a> Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).</li>
<li>Andreasen, N. C., Pierson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cerebellum+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The role of the cerebellum in schizophrenia.</a> Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).</li>
<li>Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MRI+study+of+cerebellar+vermis+morphology+in+patients+with+schizophrenia%3A+Evidence+in+support+of+the+cognitive+dysmetria+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept.</a> Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).</li>
<li>Jacobsen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+morphology+of+the+cerebellum+and+fourth+ventricle+in+childhood-onset+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia.</a> American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).</li>
<li>Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+gene+expression+profile+of+axon+guidance+cues+in+Purkinje+cells+during+cerebellar+circuit+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation.</a> The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).</li>
<li>Kim, D., Ackerman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UNC5C+netrin+receptor+regulates+dorsal+guidance+of+mouse+hindbrain+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).</li>
<li>Maier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+4C+and+4G+are+ligands+of+Plexin-B2+required+in+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).</li>
<li>Telley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+NRP1+in+axon+guidance+and+subcellular+target+recognition+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum.</a> Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Scientific Reports. 5, 9232(2015).</li>
<li>Shabanipour, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+neurons+isolated+from+embryonic+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60168(2019).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.

تعد القدرة على نمذجة نمو المخيخ البشري في المختبر مهمة لنمذجة الأمراض بالإضافة إلى تعزيز فهم نمو الدماغ الطبيعي. تخلق البروتوكولات الأقل تعقيدا وفعالية من حيث التكلفة المزيد من الفرص لتوليد البيانات القابلة للتكرار والتنفيذ الواسع عبر مختبرات علمية متعددة. يتم وصف بروتوكول تمايز المخيخ هنا باستخدام طريقة معدلة لتوليد EBs التي لا تتطلب إنزيمات أو عوامل تفكك ، باستخدام عوامل النمو التي أبلغ عنها Muguruma et al. 4 وبروتوكول نمو خلية أحادي الطبقة 2D معدل مشابه للطريقة من Holmes et al...

إن فهم تطور المخيخ البشري والنوافذ الزمنية الحرجة لهذه العملية أمر مهم ليس فقط لفك تشفير الأسباب المحتملة لاضطرابات النمو العصبي ولكن أيضا لتحديد أهداف جديدة للتدخل العلاجي. كانت نمذجة تطور المخيخ البشري في المختبر صعبة ، ولكن بمرور الوقت ، ظهرت العديد من البروتوكولات التي تميز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) أو iPSCs مع مصائر النسب المخيخي1،2،3،4،5،6،7،8 . علاوة على ذلك ، من المهم تطوير بروتوكولات تولد نتائج قابلة للتكرار ، وبسيطة نسبيا (لتقليل الخطأ) ، وليست ثقيلة على التكاليف النقدية.
تم إنشاء البروتوكولات الأولى للتمايز المخيخي من ثقافات 2D من الأجسام الجنينية المطلية (EBs) ، مما أدى إلى مصير المخيخ مع عوامل نمو مختلفة مماثلة لتطور الجسم الحي ، بما في ذلك WNT و BMPs و FGFs 1,9. أحدث البروتوكولات المنشورة المستحثة التمايز في المقام الأول في ثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد مع FGF2 والأنسولين ، تليها FGF19 و SDF1 للهياكل الشبيهة بالشفاهالمعينية 3،4 ، أو استخدمت مزيجا من FGF2 و FGF4 و FGF85. أدت كلتا طريقتي تحريض المخيخ العضوي إلى عضويات مخيخية 3D مماثلة حيث أبلغ كلا البروتوكولين عن تعبير علامة مخيخ مماثل في نقاط زمنية متطابقة. قام هولمز وهاين بتوسيع بروتوكول 3D5 الخاص بهما لإظهار أنه يمكن توليد خلايا المخيخ ثنائية الأبعاد من hESCs و iPSCs ، والتي تبدأ كمجاميع ثلاثية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر Silva et al.7 أن الخلايا التي تمثل الخلايا العصبية المخيخية الناضجة في 2D يمكن توليدها بنهج مشابه لهولمز وهاين ، باستخدام نقطة زمنية مختلفة للتبديل من 3D إلى 2D وتمديد وقت النمو والنضج.
يحث البروتوكول الحالي على مصير المخيخ في iPSCs الخالية من التغذية عن طريق توليد أجسام جنينية حرة عائمة (EBs) باستخدام الأنسولين و FGF2 ثم طلاء EBs على أطباق مغلفة ب PLO / laminin في اليوم 14 للنمو والتمايز ثنائي الأبعاد. بحلول اليوم 35 ، يتم الحصول على خلايا ذات هوية مخيخية. القدرة على تلخيص المراحل المبكرة من تطور المخيخ ، وخاصة في بيئة 2D ، تسمح للباحثين بالإجابة على أسئلة محددة تتطلب تجارب مع بنية أحادية الطبقة. هذا البروتوكول قابل أيضا لمزيد من التعديلات مثل الأسطح الدقيقة ، ومقايسات النمو المحوري ، وفرز الخلايا لإثراء مجموعات الخلايا المطلوبة.

<table><tbody><tr><td>10 مل ماصة مصلية</td><td>فيشر Scientific</td><td>13-678-26D</td><td></td></tr><tr><td>1-thio-glycerol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2 مل ماصة مصلية</td><td>فيشر Scientific</td><td>13-678-26B</td><td></td></tr><tr><td>250 مل وحدة تصفية ، 0.2 & micro ؛ م aPES ، 50 مم ضياء</td><td>فيشر Scientific</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>35 مم سهل الإمساك بطبق الأنسجة النازلة</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>4D Nucleofector الوحدة الأساسية</td><td>Lonza</td><td>276885</td><td>Nucleofector</td></tr><tr><td>5 مل ماصة مصلية</td><td>فيشر Scientific</td><td>13-678-25D</td><td></td></tr><tr><td>60 مم طبق ثقافة الأنسجة سهل الإمساك</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>6 بئر لوحات التثبيت منخفضة للغاية</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>9 "Pasteur Pipets Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>ألبومين مصل الأبقار (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>مزرعة الخلية من الدرجة</td><td>المياه Cytiva</td><td>SH30529.02</td><td></td></tr><tr><td>تركيز الدهون المحدد كيميائيا</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Cayman</td><td>34681</td><td></td></tr><tr><td>Class II ، النوع A2 ، خزانة السلامة البيولوجية</td><td>NuAire، Inc.</td><td>NU-540-600</td><td>غطاء محرك السيارة ، ضوء الأشعة فوق البنفسجية</td></tr><tr><td>Costar 24 بئر ، TC معالج</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-well لوحة ،</td> TC معالج <td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>محلول DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (كبريتات ثنائي الميثلي)</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DPBS +/+</td> <td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Cayman</td><td>22204</td><td></td></tr><tr><td>Epi5 مجموعة إعادة برمجة iPSC العرضية</td><td>Life Technologies</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8-Flex</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>PSC المتوسطة مع نظام التصوير الأساسي FGF2</td></tr><tr><td>EVOS XL</td> المستقر <td>للحرارة Life Technologies</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنينية - Premium Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>مكمل GlutaMAX</td><td>مكمل جيبكو</td><td>35050061</td><td>مكمل L-alanine-L-glutamine</td></tr><tr><td>Ham's F12 Nutrient Mix</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i حاضنة CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>الإنسان المضاد ل EN2 ، الماوس</td><td>سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية</td><td>sc-293311</td><td></td></tr><tr><td>الإنسان المضاد ل Ki67 / MKI67 ، الأرنب</td><td>R & D Systems</td><td>MAB7617</td><td></td></tr><tr><td>الإنسان المضاد ل PTF1a ، الأرنب</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-98726</td><td></td></tr><tr><td>الإنسان المضاد ل TUBB3 ، الفأر</td><td>Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>الأنسولين</td><td>جيبكو</td><td>12585</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Mouse Protein</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>مصفوفة غشاء كورنينج</td><td>354234</td><td>الطابق</td></tr><tr><td>السفلي MEM-NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي صغير</td><td>Labnet International</td><td>C1310</td> جهاز <td>طرد مركزي صغير منضدة</td></tr><tr><td>طقم تنظيف الحمض النووي الريبي العاهل (50 وميكرو ؛ ز)</td> <td>نيو إنجلاند BioLabs</td><td>T2040</td><td>أعمدة دوران السيليكا</td></tr><tr><td>Monarch Total RNA Miniprep Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>T2010</td><td>أعمدة دوران السيليكا</td></tr><tr><td>N-2</td><td>مكمل Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>المتوسط العصبي</td><td>القاعدي Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16٪</td> <td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>مكمل بولي أمين</td><td>سيجما</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>بولي إل أورنيثين (PLO)</td> <td>سيجما</td><td>3655</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم</td><td>سيجما</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>سيجما</td><td>54317</td><td></td></tr><tr><td>انظر من خلال الحقائب ذاتية الإغلاق</td><td>Steriking</td><td>SS-T2 (90x250)</td> أكياس <td>الأوتوكلاف</td></tr><tr><td>الصوديوم سيترات ثنائي هيدرات&nbsp;</td>مرشحات حقنة <td>فيشر Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>، معقمة ، PES 0.22 & micro ؛ م ، 30 مم</td><td>Dia Research Products International</td><td>256131</td><td></td></tr><tr><td>Trans-ISRIB</td><td>Cayman</td><td>16258</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>الفينول والجوانيدين إيزوثيوسيانات</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td> <td>Gibco</td><td>12604039</td><td>كاشف تفكك الخلية &nbsp ؛</td></tr><tr><td>مقياس التناضح لضغط البخار</td><td>Wescor، Inc.</td><td>نموذج 5520</td><td>مقياس التناضح</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biogems</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

نمذجة تطور المخيخ البشري في المختبر في هيكل 2d

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

يعد التطور الدقيق وفي الوقت المناسب للمخيخ أمرا بالغ الأهمية ليس فقط للتنسيق والتوازن الحركي الدقيق ولكن أيضا للإدراك. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاضطراب في نمو المخيخ متورط في العديد من اضطرابات النمو العصبي ، بما في ذلك التوحد واضطراب نقص الانتباه وفرط النشاط (ADHD) والفصام. لم تكن التحقيقات في تطور المخيخ لدى البشر ممكنة في السابق إلا من خلال دراسات ما بعد الوفاة أو التصوير العصبي ، ومع ذلك فإن هذه الطرق ليست كافية لفهم التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث في الجسم الحي أثناء التطور المبكر ، وهو الوقت الذي تنشأ فيه العديد من اضطرابات النمو العصبي. إن ظهور تقنيات لتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) من الخلايا الجسدية والقدرة على إعادة تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا عصبية قد مهدت الطريق للنمذجة في المختبر لنمو الدماغ المبكر. تقدم الدراسة الحالية خطوات مبسطة نحو توليد خلايا مخيخية للتطبيقات التي تتطلب بنية أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (2D). يتم اشتقاق الخلايا المخيخية التي تمثل مراحل النمو المبكرة من iPSCs البشرية من خلال الخطوات التالية: أولا ، تصنع الأجسام الجنينية في ثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) ، ثم يتم معالجتها باستخدام FGF2 والأنسولين لتعزيز مواصفات مصير المخيخ ، وأخيرا ، يتم تمييزها بشكل نهائي كطبقة أحادية على ركائز بولي إل أورنيثين (PLO) / لامينين المغلفة. في 35 يوما من التمايز ، تعبر مزارع الخلايا المخيخية المشتقة من iPSC عن علامات المخيخ بما في ذلك ATOH1 و PTF1α و PAX6 و KIRREL2 ، مما يشير إلى أن هذا البروتوكول يولد سلائف الخلايا العصبية المخيخية glutamatergic و GABAergic ، بالإضافة إلى أسلاف خلايا Purkinje. علاوة على ذلك ، تظهر الخلايا المتمايزة مورفولوجيا عصبية مميزة وهي إيجابية لعلامات التألق المناعي للهوية العصبية مثل TUBB3. تعبر هذه الخلايا عن جزيئات التوجيه المحوري ، بما في ذلك semaphorin-4C و plexin-B2 و neuropilin-1 ، ويمكن أن تكون بمثابة نموذج للتحقيق في الآليات الجزيئية لنمو الخلايا العصبية والاتصال المشبكي. تولد هذه الطريقة خلايا عصبية مخيخية بشرية مفيدة للتطبيقات النهائية ، بما في ذلك التعبير الجيني والدراسات الفسيولوجية والمورفولوجية التي تتطلب تنسيقات أحادية الطبقة 2D.

نظرة عامة على تمايز المخيخ 3D إلى 2D يتم إنشاء الخلايا المخيخية بدءا من iPSCs. يوضح الشكل 1 أ سير العمل العام وإضافة المكونات الرئيسية للتمايز. في اليوم 0 ، يتم تصنيع EBs عن طريق رفع مستعمرات iPSC برفق (الشكل 1B) باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة في CDM تحتوي على SB431542 و Y-27632 وتوضع في ألواح ملحقة منخفضة للغاية. يضاف FGF2 في اليوم الثاني. في اليوم 7 ، يتم تغيير ثلث الوسيط ، ويلاحظ تكوين EB (الشكل 1C). في اليوم 14 ...

يشرح البروتوكول الحالي توليد طبقة أحادية 2D من الخلايا المخيخية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات للتحقيق في المراحل المبكرة من تطور المخيخ.

نمذجة تطور المخيخ البشري في المختبر في هيكل 2D

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في دراسة التطور المبكر للمخيخ البشري وكيف يمكن تغييره في الاضطرابات العصبية والنفسية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي توليد خلايا مخيخية بشرية مبكرة من الناحية التنموية في بنية طبقة 2D دون تنفيذ خطوات معقدة. كما أنها فعالة من حيث التكلفة.قد يكون صنع ماصات السحب أمرا صعبا في البداية ، ولكن مع الممارسة والوقت ، يصبح من الأسهل سحب الماصات بطريقة يسهل التعامل معها. ابدأ التحضير التجريبي بسحب ماصة باستور طولها 22.9 سم أسفل الرقبة بمقدار سنتيمترين تقريبا ، فوق موقد بنسن لإنشاء ماصات زجاجية. سيكون الجانب الأرق أقصر بأربعة سنتيمترات تقريبا من الآخر.ثني أطراف الجانب المسحوب على اللهب لإنشاء R سلس ، ثم ضع الماصات المسحوبة في أكمام الأوتوكلاف وقم بتعقيمها في الأوتوكلاف. في اليوم صفر ، أضف ملليلترا واحدا من وسط تمايز المخيخ المكمل ب 10 ميكرومولار Y-27632 و SB-431542 إلى كل بئر من ملحق منخفض للغاية من ستة آبار ، أو ULA ، لوحة ، وضعه في الحاضنة حتى تصبح المستعمرات المرفوعة جاهزة للإضافة إلى الآبار. نظف الخلايا المتمايزة باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة.نضح الوسط وأضف ملليمتر واحد من محلول تمرير iPSC لكل طبق 35 ملم. بعد ثلاث دقائق من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، استنشق الوسط وأضف ملليمترين من وسط تمايز المخيخ المكمل ب 10 ميكرومولار Y-27632 و SB-431542 تحت تكبير 4x لمجهر مقلوب بالضوء المرسل ، ارفع المستعمرات باستخدام الحافة المنحنية للماصة الزجاجية المسحوبة. بمجرد رفع كل مستعمرة ، انقل جميع المستعمرات برفق إلى بئر واحد من لوحة ULA المكونة من ستة آبار باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر.كرر هذه العملية لكل لوحة iPSC واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثاني ، أضف FGF2 إلى كل بئر لضبط التركيز النهائي البالغ 50 نانوجرام لكل ملليلتر. في اليوم السابع، قم بتغيير ثلث الوسط عن طريق استنشاق ملليلتر واحد من الوسط المستهلك واستبداله بملليلتر واحد من وسط تمايز المخيخ الجديد.احتضان الأجسام الجنينية لمدة سبعة أيام. في اليوم 14 ، قم بتدوير اللوحة لجمع كل الأجسام الجنينية في وسط اللوحة. ثم قم بإمالة اللوحة وشفط كل الوسط المستهلك باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر من الحافة.مع انخفاض الكمية المتوسطة ، ضع اللوحة ببطء بشكل مسطح واستمر في الشفط ، تاركا وسطا كافيا لتجنب سحب الأجسام الجنينية. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط تمايز المخيخ الطازج مع 10 ميكرومولار Y-27632. ثم انقل الأجسام الجنينية باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر إلى طبق مطلي ب Poly-L-Ornithine Laminin.في اليوم 15 ، استنشاق الوسط واستبداله بوسط تمايز مخيخي جديد. في اليوم صفر ، تم تنظيف مستعمرات iPSC ورفعها إلى وسط تمايز مخيخي يحتوي على SB-431542 و Y-27632 وتم وضعها في ألواح ربط منخفضة للغاية لتوليد أجسام جنينية. أدت إضافة FGF2 في اليوم الثاني وتغيير 1/3 وسيط في اليوم السابع إلى تضخم الأجسام الجنينية في اليوم الرابع عشر.بدأت الخلايا تهاجر إلى الخارج من الأجسام الجنينية على طول السطح المطلي في اليوم 15. أدى التغيير الكامل للوسط إلى وسط النضج المخيخي من اليوم 21 إلى طبقة أحادية من الخلايا ذات التشكل الشبيه بالخلايا العصبية والتعقيد بحلول اليوم 35. كشف تحليل التعبير الجيني في اليوم 35 أن الخلايا تعبر عن علامات السلف المخيخي المبكرة مثل السلف glutamatergic ، ATOH1 ، GABAergic progenitors ، PTF1 alpha ، وعلامات الخلايا السلفية Purkinje KIRREL2 و SKOR2.بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أيضا التعبير عن علامة الشفاه المعينية OTX2 ومعظمها SIX3 الخاص بالخلايا العصبية الأمامية. أظهر وضع العلامات المناعية للخلايا التي تم حصادها في اليوم 35 تلطيخا إيجابيا لعلامات المخيخ EN2 و PTF1 alpha ، والعلامة العصبية بيتا توبولين III ، وعلامة الانتشار KI67. أظهر التلوين النووي مع 4'6-diamidino-2-phenylindole ، أو DAPI ، نوى الخلية.من أجل التمايز الناجح ، من الأهمية بمكان البدء بمستعمرات iPSC صحية وغير متمايزة واستخدام الكواشف التي يتم إعادة تشكيلها حديثا قدر الإمكان.

modeling-human-cerebellar-development-in-vitro-in-2d-structure

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا للتمييز بين الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية إلى أسلاف مخيخية. يتضمن نقل مستعمرات الخلايا الجذعية إلى صفيحة تعلق منخفضة للغاية لتشكيل أجسام جنينية ، وتعزيز التمايز مع عوامل النمو ، ثم نقل الأجسام الجنينية إلى صفيحة مغلفة بالمصفوفة للالتصاق. تتضمن الخطوات اللاحقة تحفيز هجرة الخلايا وإضافة وسيط النضج لتوجيه تطور السلائف العصبية المخيخية الجلوتاماتية وGABAergic وأسلاف خلايا بركنجي.

تقنية لتوليد طبقة أحادية ثنائية الأبعاد من الخلايا المخيخية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات

يوضح هذا الفيديو إنشاء نموذج إصابة الخلايا العصبية في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية الأولية للفأر. يحدد الخطوات المتبعة في إحداث إصابة الخلايا العصبية باستخدام NMDA ، ناهض مستقبلات الناقل العصبي المثير ، والجلايسين ، وهو ناهض مشارك. يرتبط NMDA و glycine بمستقبلات عصبية معينة ، مما يتسبب في فرط تحفيزها ويؤدي إلى تدفق هائل للكالسيوم داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى تلف الخلايا العصبية والموت.

نمذجة إصابة الخلايا العصبية في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية الأولية للفأر

الطبقة الحبيبية الخارجية للدماغ هي موقع أكبر التضخيم العابر في الدماغ النامية. هنا، نقدم بروتوكول لاستهداف التعديل الوراثي لهذه الطبقة في ذروة انتشار استخدام خارج الجسم الحي Electroporation للوثقافة شرائح للدماغ من الجنينية يوم 14 افراخ الدجاج.

فيفو السابقين الثقافة من الفرخ مخيخي شرائح المستهدفة ومكانيا Electroporation للمن الحبيبة السلائف الخلية

ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل واستزراع الماوس الأساسي الحبيبية الدماغي الخلايا العصبية (كنس) من يوم 6-7 القديمة الجراء، كفاءة توصيل لكنس للخسارة والحصول على دراسات مهمة، ونمذجة excitotoxicity الخلايا العصبية التي يسببها نمدا، موت الخلايا التي يسببها البوتاسيوم منخفضة وتلف الحمض النووي، والأكسدة باستخدام نفس نموذج الثقافة.

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

ونحن تصف متوسطة بروتوكول هبسكس، باستخدام تعريف تمايز 3D مبسطة وتخفيض عوامل النمو، قادرة على توليد المجاميع الخلية مع أوائل نيوروبيثيليال الهياكل وإيجابية بالنسبة لعلامات مرتبطة بالدماغ، فضلا عن اختياري 2D التعديل للتفريق بين الخلايا كأحادي الطبقة لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية.

بروتوكول التمايز الدماغ 3D مبسطة مع التعديل 2D اختياري

هنا نقدم طريقة لإعداد أورجانوتيبيك الثقافات شريحة من المخيخ الماوس وغمد المايلين تلطيخ من إيمونوهيستوتشيميستري مناسبة للتحقيق في آليات مييلينيشن وريميلينيشن في الجهاز العصبي المركزي.

إعداد و Immunostaining أورجانوتيبيك ميليناتينج شريحة الدماغ الثقافات

يصف هذا البروتوكول نظامًا ديناميكيًا لثقافة إنتاج مجاميع حجم متحكم فيها للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وزيادة تحفيز التمايز في الأعضاء الدماغية في ظل ظروف محددة كيميائيًا وخالية من التغذية باستخدام مفاعل حيوي أحادي الاستخدام.

التوليد القابل للتحجيم من العضيات الدماغية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات والتوصيف عن طريق المناعة

نصف هنا طريقة لتصور تكوين المشابك العصبية الحبيبية في مخيخ الفأر على مدار فترة نمو الدماغ بعد الولادة عندما تقوم هذه الخلايا بتحسين هياكلها المشبكية وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي لدمج نفسها في دائرة الدماغ الكلية.

الاستفادة من التثقيب الكهربائي بعد الولادة في الجسم الحي لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية وتطوير المشبك

نحن نقدم بروتوكولات مفصلة لتوليد وتوصيف 2D و 3D المستحثة بالإنسان الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hIPSC) القائمة على تطوير القشرة المخية الحديثة بالإضافة إلى منهجيات تكميلية تمكن من التحليل النوعي والكمي للنشأة الحيوية الأولية (PC) ووظيفتها.

2D و 3D المستحثة من قبل الإنسان نماذج الخلايا الجذعية متعددة القدرات القائمة على تشريح تورط سيليوم الأولية أثناء تطور القشرة المخية الجديدة

هذا الفيديو يوضح طريقة لتشريح والثقافة الخلايا العصبية صواري E13 من الحبل الشوكي الفئران الظهرية. فصل الخلايا العصبية صواري مفيدة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للنمو محور عصبي والتوجيه.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

اكتشف نمذجة تطور المخيخ البشري في المختبر باستخدام خلايا جذعية متعددة القدرات المستحثة. يتيح هذا النهج دراسة آليات التطور العصبي المبكر والاضطرابات النفسية العصبية ذات الصلة.

نمذجة تطور المخيخ البشري في المختبر في هيكل 2D

استكشف المزيد من الفيديوهات