الدوائر الرقمية الجينية القائمة على أنظمة CRISPR-Cas والبروتينات المضادة ل CRISPR

يشرح بروتوكولنا كيفية تصميم وبناء وتحليل الدوائر الرقمية لجينات الخميرة التي تستخدم أنظمة CRISPR dCas من النوع الثاني والنوع الخامس والبروتينات المضادة ل CRISPR المقابلة. إنه يبقى التجميع لأنه لا يجمع أي إجراءات قياسية لتجميع واختبار شبكات النسخ الاصطناعية في الخدمات. للبدء ، قم بإعداد خليط تفاعل يحتوي على 20 إلى 40 نانوجرام من قالب الحمض النووي ، وميكرولتر واحد من التمهيدي الأمامي ، وميكرولتر واحد من التمهيدي العكسي ، وخمسة ميكرولتر من مزيج DNTP ، و 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي ، و 10 ميكرولتر من 5x عازلة تفاعل بوليميراز الحمض النووي ، وماء مقطر مزدوج يصل حجمه الإجمالي إلى 50 ميكرولتر.

قم بتضخيم تسلسل الحمض النووي باستخدام برنامج PCR للهبوط على جهاز تدوير حراري كما هو موضح في المخطوطة. اعزل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي وقم بتخفيف تسلسل الحمض النووي من هلام الأغاروز عبر مجموعة استخراج هلام الحمض النووي. باستخدام طريقة تجميع جيبسون ، أدخل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى في ناقل المكوك المفتوح عن طريق السماح بدخول خليط الحمض النووي المتساوي المولي عند 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.