التصوير داخل الجسم لتعبير البروتين الفلوري في الفئران المصابة بإصابة دماغية رضحية مغلقة الجمجمة ونافذة الجمجمة باستخدام مجهر ثنائي الفوتون

توضح هذه الدراسة تسليم إصابة دماغية رضحية متكررة للفئران وزرع متزامن لنافذة الجمجمة للتصوير اللاحق داخل الجسم ل EGFP المعبر عنه بالخلايا العصبية باستخدام المجهر ثنائي الفوتون.

يوفر بروتوكولنا طريقة لتصور الاستجابة العصبية للإجهاد الميكانيكي في فأر حي ، والتي يمكن أن توفر دليلا مباشرا على كيفية تأثير إصابات الدماغ الرضحية على الدماغ. يمكن لهذه التقنية مراقبة البروتين المستهدف في نفس موقع الدماغ في نفس الحيوان لكل من المراحل الحادة والمزمنة بعد إصابة الدماغ الرضحية. يمكن تغيير الجين محل الاهتمام ومروج الفيروس وفقا لذلك لدراسة البروتينات الأخرى في أنواع الخلايا المحددة في الدماغ.

للبدء ، ضع مرهم العيون على عيون الفأر المخدر. قم بإزالة الشعر من أعلى الرأس عن طريق التشذيب بالمقص العادي. بعد إنشاء شق خط الوسط بطول 12 إلى 15 ملم ، قم باستئصال الجلد فوق نصفي الكرة الأيسر والأيمن من الجمجمة باستخدام مقص زنبركي منحني.

بمجرد انكشاف الجمجمة ، قم بإزالة السمحاق عن طريق فركه برفق باستخدام قضيب معقم ذو رأس قطني ، وشطفه بمحلول ملحي معقم. بمجرد تجفيف منطقة الجمجمة ، حدد موقع تأثير إصابات الدماغ الرضحية ، أو TBI ، عند الإحداثيات 2.5 ملم خلف البريغما واثنين ملليمترات جانبية من الخيط السهمي إلى اليمين. قم بإزالة الماوس بسرعة من الإطار التجسيمي وضع الرأس على وسادة العازلة أسفل جهاز TBI.

قم بمحاذاة طرف الصدمة مع موقع الارتطام المحدد. ارفع العمود المعدني عن طريق سحب خيط النايلون المربوط 15 سم فوق رأس الماوس ، ثم حرره ، مما يسمح للوزن بالسقوط بحرية على قضيب محول الطاقة ، الذي يتلامس مع الجزء العلوي من الجمجمة في موقع TBI. ضع رأس الفأر المخدر على الإطار التجسيمي المحفوظ تحت المجهر الجراحي.

قم بحفر سطح الجمجمة برفق وببطء باستخدام لقمة كربيد FG4 بسرعة دوارة منخفضة لإزالة السمحاق المتبقي ، وإنشاء سطح جمجمة خشن بحيث يرتبط الأسمنت السني بإحكام بالجمجمة. استخدم محلول ملحي لطرد وإزالة غبار العظام من سطح الجمجمة. لفصل العضلات الجانبية عن الجمجمة ، على بعد حوالي خمسة ملليمترات خلف العين ، حيث يوجد الخيط الذي يربط الجمجمة الجدارية والزمنية ، أدخل الأطراف المغلقة الدقيقة برفق وحرك الأطراف المغلقة برفق في الاتجاه الخلفي حتى خياطة اللمبويد.

افصل العضلات الجانبية على الجانب الذي سيحدث فيه زرع نافذة الجمجمة. اغسل الحطام من موقع الجراحة باستخدام محلول ملحي وجفف المنطقة بالشاش. لزرع عمود الرأس ، ضع علامة على نقطة المركز 2.5 ملم خلف البريغما و 1.5 ملم من الخيط السهمي في نصف الكرة الأيمن باستخدام قلم تحديد والفرجار الجراحي.

ثم تتبع محيط حج القحف على الجمجمة النظيفة والجافة. قم بفك شريط الأذن وتدوير الرأس ، بحيث تكون طائرة حج القحف أفقية تماما ، ثم شد شريط الأذن مرة أخرى. استخدمي العصا الخشبية لأداة التطبيق ذات الرؤوس القطنية لإضافة قطرتين صغيرتين من الغراء الفائق إلى الحافة الأمامية والخلفية لعمود الرأس.

ضع عمود رأس التيتانيوم فوق مركز حج القحف ، واضبطه بسرعة للراحة داخل نفس المستوى حيث سيتم زرع نافذة الجمجمة. استخدم ضغطا خفيفا حتى يجف الغراء الفائق ، والذي يستغرق عادة حوالي 30 ثانية. قم بإعداد أسمنت الأسنان في طبق خزفي مبرد مسبقا عن طريق خلط 300 ملليغرام من مسحوق الأسمنت وست قطرات من سائل QuickBase وقطرة واحدة من المحفز.

ضع كمية وفيرة من خليط الأسمنت السني بسرعة على المحيط الخارجي للمحيط المتتبع وقم بتغطية أي سطح عظمي مكشوف. ومع ذلك ، لا تغطي موقع حج القحف. حرر قضيب الأذن وقم بتثبيت عمود الرأس بالإطار المعدني للتأكد من أن الرأس مستقر للحفر الدقيق على طول محيط حج القحف المحدد.

لإجراء حج القحف ، استخدم الفرجار الجراحي للتحقق من قطر الدائرة المحددة كما هو موضح من قبل ، وضبطه حسب الضرورة ، بحيث تتناسب نافذة الجمجمة بشكل مريح داخل حج القحف. باستخدام مثقاب الأسنان الكهربائي ، قم بحفر الجمجمة وتخفيفها على طول الجزء الخارجي من الدائرة المحددة باستخدام لقمة كربيد FG4 أولا ، مما يخلق مسارا يمكن من خلاله ترقق الجمجمة. ري المنطقة بالمحلول الملحي لغسل غبار العظام.

استمر في ترقق الجمجمة باستخدام لقمة كربيد FG 1/4 حتى تصبح الجمجمة رقيقة وشفافة. بشكل دوري ، توقف عن الحفر ، وقم بري المنطقة بأكملها بمحلول ملحي معقم مرة أخرى لتقليل التسخين من المثقاب وغسل غبار العظام. أكمل ترقق الجمجمة باستخدام بت كربيد EF4 ، واستمر في التخفيف والحفر عبر بقية الجمجمة على طول المسار.

أدخل ملقط ذو رأس رفيع 0.5 ملم عبر المكان المتصدع ، وارفع رفرف العظم برفق لأعلى دون وضع مسافة بادئة للدماغ الأساسي. بعد إزالة رفرف العظام ، قم بري منطقة حج القحف بالمحلول الملحي. باستخدام الملقط الجراحي المنحني ، قم بإزالة المادة العنكبوتية المرئية برفق.

استخدم الملقط الجراحي ذي الرؤوس المستقيمة لالتقاط النافذة الزجاجية المعقمة مع توجيه الغطاء الزجاجي مقاس ثلاثة ملليمترات لأسفل. ضع النافذة الزجاجية واضبطها فوق موقع حج القحف للتأكد من أن النافذة يمكن أن تتناسب بشكل مريح مع حافة حج القحف. انزلاق الغطاء الزجاجي خمسة ملليمترات في الأعلى.

قم بإعداد الأسمنت السني كما هو موضح سابقا ، وانتظر حوالي ست دقائق حتى يصبح الأسمنت فطيرة وسميكة. أثناء انتظار أن يصبح الأسمنت فطيرة وسميكة ، ضع قدرا كافيا من الضغط على النافذة من خلال مناور تجسيمي للتحقق من أن الجمجمة يمكنها الاتصال بالنافذة الزجاجية بشكل آمن وبإحكام. استخدم فرشاة تطبيق دقيقة قابلة للتعديل لإضافة كمية صغيرة من الأسمنت بجانب حافة النافذة لإغلاق النافذة الزجاجية بالجمجمة.

انتظر حوالي 10 دقائق حتى يجف الأسمنت تماما ، ثم حرره برفق ، وقم بإزالة المعالج فوق النافذة. أكمل عن طريق تقليم الأسمنت السني باستخدام مثقاب الأسنان مع لقمة كربيد FG4 إذا كان الأسمنت الزائد يغطي النافذة. في حوالي أربع ساعات بعد الجراحة ، تم إجراء تصوير ثنائي الفوتون ، حيث ظهرت الأوعية الدموية على المستوى السطحي باللون الأسود ، وعلى المستوى العميق لحوالي 400 ميكرومتر ، تم توزيع تعبير بروتين EGFP بشكل منتشر في جميع أنحاء جسم الخلية.

في أسبوع وأربعة أشهر بعد إصابات الدماغ الرضية ، تم استخدام نمط الأوعية الدموية الذي لوحظ في نقطة الصفر كمرجع لتحديد نفس منطقة التصوير. نمط الأوعية الدموية مشابه لذلك في اليوم صفر. وبالمثل ، تم الكشف عن تعبير EGFP في جميع أنحاء جسم الخلية.

كانت شدة التألق في اليوم صفر وأربعة أشهر متشابهة على المستويين السطحي والأعمق. ومع ذلك ، كانت شدة التألق في أسبوع واحد أقل من اليوم صفر وأربعة أشهر ، ربما بسبب القمع الانتقالي المبلغ عنه لنماذج TBI الأخرى. من الأهمية بمكان توخي أقصى درجات الحذر عند إجراء خطوة حج القحف لتجنب إتلاف أنسجة المخ.

لا تقم بإدخال طرف الحفر في الدماغ. باستخدام هذه التقنية ، يمكن للباحثين تصور البروتينات المختلفة ذات الأهمية في نفس الخلية طوليا عبر مراحل مختلفة بعد إصابات الدماغ الرضية ، مما يوفر معلومات حول توطين هذا البروتين والتعبير عنه وقابليته للذوبان في دماغ الثدييات بعد الصدمة.