التشريح المجهري والمجهر الإلكتروني الماسح الكامل للجبل تصور الضفيرة المشيمية للفأر
December 16th, 2022
تلعب الضفيرة المشيمية (CP) ، وهي نسيج غير مدروس في علم الأعصاب ، دورا رئيسيا في صحة ومرض الجهاز العصبي المركزي. يصف هذا البروتوكول تقنية التشريح المجهري لعزل CP واستخدام المجهر الإلكتروني الماسح للحصول على رؤية شاملة لهيكله الخلوي.
للحصول على رؤية أفضل في تكوين وهيكل الضفيرة المشيمية ، فإن الطريقة الفعالة لعزل الضفيرة المشيمية خارج البطينين في الدماغ هي خطوة أولى لا تقدر بثمن. باستخدام تقنية التشريح المجهري هذه ، من الممكن تشريح الضفيرة المشيمية من البطينين في الدماغ مع احتواء وظيفتها وصلاحيتها وهيكلها دون تلويث الضفيرة المشيمية بالأنسجة المحيطة. تتمثل إحدى العقبات المهمة في عزل الضفيرة المشيمية في تحديد البنية لأنها لا تزال تطفو في بطينات الدماغ.
تلطيخ الضفيرة المشيمية مع بروموفينول الأزرق يسهل العزل. سيوضح الإجراء إليان فان وونترجيم ، مدير مختبرنا. ابدأ بإعداد مخدر طرفي ، محلول نضح عبر القلب ، وحل مطلوب لمسح المجهر الإلكتروني ، أو SEM ، وحلول أخرى كما هو مذكور في النص.
لعزل دماغ الفأر ، ضع الحيوان المخدر الميؤوس من شفائه في وضع الاستلقاء الظهري ، وقم بتثبيت الفأر عن طريق تثبيت الأطراف على طبق. تطهير الصدر عن طريق رش 70٪ من الإيثانول قبل إجراء شق يبلغ حوالي أربعة سنتيمترات أسفل الحجاب الحاجز مباشرة باستخدام شفرة جراحية من الفولاذ الكربوني. افتح الجلد وكشف الصدر باستخدام مقص جراحي.
قطع الحجاب الحاجز مفتوحا تماما وفصل الصدر لكشف الرئتين والقلب النابض. باستخدام مضخة التروية ، قم بتهوية الماوس ب 10 ملليلتر من محلول التروية بمعدل 4.5 ملليلتر في الدقيقة. أدخل إبرة قياس 26 في البطين الأيسر لضخ المحلول في الدائرة الجهازية.
باستخدام المقص الجراحي ، قم بقطع الأذين الأيمن لخروج الدم من الدورة الدموية. بعد قطع رأس الفأر ، قم بفتح فروة الرأس عن طريق إجراء شق يبدأ بين الأذنين إلى أعلى من العينين. اسحب الجلد بشكل جانبي لكشف الجمجمة.
ثم اقطع الجمجمة باتباع الغرز الحرشفية باتجاه الجزء الأنفي. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع الدماغ في طبق بتري بارد مثلج ، وأضف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني بارد مثلج إلى أنسجة المخ. لعزل الضفيرة المشيمية العائمة في البطين الرابع ، قم بقطع المخيخ برفق عن المخ باستخدام مشرط.
إزالة أجزاء أنسجة جذع الدماغ المتبقية من المخيخ. قم بتدوير الدماغ بحيث يكون خط القطع متجها لأعلى ، مع التأكد من أن تجويف البطين الرابع مرئي في منتصف القسم مع وجود الضفيرة المشيمية في الموقع الظهري. إذا لزم الأمر ، افتح البطين عن طريق سحب النسيج الضام بملقط حاد.
تمزيق الضفيرة المشيمية برفق من جدار البطين باستخدام ملقط حاد صغير. لعزل الضفيرة المشيمية عن البطين الجانبي ، قم بقطع الدماغ سهميا إلى نصفي الكرة الأرضية باستخدام ملقط حاد صغير. قم بتدوير نصف كرة دماغي واحد بحيث يكون خط القطع لأعلى.
للكشف عن البطين الجانبي ، اسحب القشرة برفق بعيدا عن المهاد. اسحب الحصين إلى خط القطع السهمي المتوسط. يمكن الآن رؤية البطين الجانبي مع وجود الضفيرة المشيمية في أسفل البطين.
إذا لزم الأمر ، افتح البطين قليلا عن طريق سحب النسيج الضام بملقط حاد. استخدم ملقط حاد صغير لتمزيق الضفيرة المشيمية برفق من جدار البطين. لإجراء تحضير العينة ل SEM ، قم بنقل الضفيرة المشيمية المعزولة حديثا إلى محلول تثبيت طازج واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من 0.1 مولار كاكوديلات الصوديوم العازلة لمدة خمس دقائق لكل منها. قم بإصلاح العينات في ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ في 0.1 مول كاكوديلات الصوديوم لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل العينات ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من الماء عالي النقاء.
بعد ذلك ، قم بتجفيف العينات في سلسلة متزايدة من تركيزات الكحول الإيثيلي البارد المثلج مع 15 دقيقة لكل محلول كحول إيثيلي. استخدم مجفف النقاط الحرجة لتجفيف العينة بشكل صحيح. ضع العينة بعناية على حامل عينة بملصق كربوني وتصور عينات الضفيرة المشيمية باستخدام SEM.
سهل البروتوكول الحالي العزل الفعال للضفيرة المشيمية من البطينين الجانبي والرابع في دماغ الفأر. أدى التروية مع البروموفينول الأزرق إلى تصور الضفيرة المشيمية. عندما لم يسمح بالبروموفينول الأزرق في خطوات المعالجة الإضافية ، تم إجراء التروية باستخدام PBS-heparin أو عدم إجراء التروية للمعالجة.
يظهر التحليل المورفولوجي SEM لسطح خلايا الضفيرة المشيمية الظهارية ، أو CPE ، بوضوح بنية ذراعي البطين الرابع والشكل النموذجي على شكل C للضفيرة المشيمية الجانبية المعزولة عن البطين الجانبي. كشف تكبير SEM الأعلى عن هياكل تشبه الحويصلة على الجانب القمي لخلايا CPE والزغابات الدقيقة ، مما يشير إلى أنه يمكن التحقيق في التغيرات المورفولوجية لخلايا CPE في حالات المرض باستخدام SEM. من المهم لمس وإخراج أنسجة الضفيرة المشيمية فقط حتى لا تلوث العينة بالأنسجة المحيطة.
توخي الحذر اللازم للحفاظ على بنية الضفيرة المشيمية. يمكن تطبيق مجموعة متنوعة من تقنيات المصب على الضفيرة المشيمية المعزولة للتحقيق في هيكلها ووظيفتها ، بدءا من تحليل المجهر على تحليل النسخ إلى قياس التدفق الخلوي. يسمح لنا التشريف المجهري للضفيرة المشيمية خارج الدماغ بالحصول على رؤية أفضل لبنية ووظيفة نسيج المخ الصغير هذا.
هذه المعرفة ضرورية لفهم دورها في الأمراض العصبية بشكل أفضل.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
توضح هذه المقالة تقنية القطع المجهري لعزلة الضفيرة المشيمية (CP) من البطينات الدماغية للفأر، بالإضافة إلى استخدام الفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM) لفحص هيكلها الخلوي. يعد فهم بنية ووظيفة الضفيرة المشيمية ضروريًا في علم الأعصاب، خاصة فيما يتعلق بتورطها في صحة الجهاز العصبي المركزي ومرضه.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم تشريح الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- الضفيرة المشيمية هي نسيج مهم ولكن لم يدرس بشكل كافٍ.
- تلعب دورًا حيويًا في صحة الجهاز العصبي المركزي وعلم الأمراض.
- العزل والتوصيف الفعال للضفيرة المشيمية له آثار على فهم الأمراض العصبية.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لعزل الضفيرة المشيمية من البطينات الدماغية للفأر.
- فحص البنية الخلوية للضفيرة المشيمية من خلال الفحص المجهري الإلكتروني الماسح.
- الحفاظ على قابلية العيش والسلامة للضفيرة المشيمية أثناء العزل.
الطرق المستخدمة
- تستخدم الدراسة تقنيات القطع المجهري لعزل الضفيرة المشيمية.
- يتم استخدام نماذج الفئران أثناء عملية العزل، مع تركيز خاص على البطين الرابع والبطين الجانبي.
- تتضمن المنهجية التخدير النهائي، الإجراءات الجراحية، والتثبيت لتحليل SEM.
- تشمل الخطوات الحرجة استخدام صبغة البروموفينول الأزرق لتحسين الرؤية، والتعامل الدقيق لتجنب التلوث.
النتائج الرئيسية
- نجح البروتوكول في عزل الضفيرة المشيمية، مما مكن من التحليل المورفولوجي من خلال SEM.
- كشفت الملاحظات عن خصائص هيكلية محددة لخلايا الظهارة الضفيرة المشيمية، بما في ذلك الشعيرات الدقيقة والهياكل الشبيهة بالحويصلات.
- تسمح هذه النتائج بإجراء تحقيقات لاحقة حول التعديلات المتعلقة بالمرض على المستوى الخلوي.
الخلاصات
- توضح هذه الدراسة نهجًا مبسطًا لعزل الضفيرة المشيمية لتحليل هيكلي مفصل.
- يمكن أن تعزز الرؤى المكتسبة فهم دور الضفيرة المشيمية في الصحة العصبية والمرض.
- بشكل عام، تُمكّن هذه الطريقة من تقدم كبير في دراسة هذا المكون الدماغي الحيوي المهم الذي غالبًا ما يتم تجاهله.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Efficient microdissection and SEM visualization of the mouse choroid plexus (CP) enable high-fidelity structural and functional analysis of this critical CNS interface. This workflow supports early discovery efforts by providing uncontaminated, viable CP tissue for downstream molecular and morphological studies, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in neurobiological research. Reliable CP isolation underpins translational continuity for CNS disease models and biomarker exploration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of CP structure and function for target validation in CNS research.
- Supports mechanistic de-risking by preserving tissue viability and minimizing contamination.
- Facilitates predictive confidence in early-stage neurobiological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides validated CP tissue for quantitative downstream assays, including transcriptomics and proteomics.
- Ensures reproducibility and standardization by maintaining structural integrity during isolation.
- Prepares samples suitable for high-resolution imaging and scalable analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Enables investigation of disease-relevant morphological changes in CP epithelial cells using SEM.
- Supports alignment of preclinical models with human CNS disease mechanisms.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking structural findings to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This microdissection and SEM protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, providing foundational tissue samples for molecular, cellular, and imaging analyses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating uncontaminated CP tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples for reproducible quantitative measurements.
- Analytics: Enables high-resolution morphological readouts and comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling disease-relevant structural studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Promotes reproducibility, standardization, and scalability in tissue preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and SEM sample preparation.
- Needs access to perfusion equipment, fixation reagents, and electron microscopy infrastructure.
- Demands strict cross-team standardization to avoid tissue contamination.
- Adaptable to other species with protocol modifications as needed.
- Careful handling is essential to preserve CP structure and downstream analytical quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:59
Microdissection of the Choroid Plexus Out of the Lateral and Fourth Ventricle
3:47
Morphological Analysis of Choroid Plexus Tissue Using Scanning Electron Microscopy (SEM)
4:48
Results: Isolation of Choroid Plexus and Analysis of Cellular Structure
5:49
Conclusion
