تحليل صورة التشفير الشريطي المتعدد للتنميط المناعي وتوصيف الخرائط المكانية في تحليل الخلية الواحدة لعينات أنسجة البارافين
أبريل 7, 2023
أدى تحليل صور الترميز الشريطي المتعدد مؤخرا إلى تحسين توصيف البيئة المكروية للورم ، مما سمح بإجراء دراسات شاملة لتكوين الخلية والحالة الوظيفية والتفاعلات بين الخلايا والخلايا. هنا ، نصف بروتوكول التلوين والتصوير باستخدام الترميز الشريطي للأجسام المضادة المقترنة قليل النوكليوتيد والتصوير الدائري ، والذي يسمح باستخدام تقنية تحليل الصور عالية الأبعاد.
يسمح الحجم الكبير للمعلومات البيولوجية التي يتم الحصول عليها من تحليل صور التشفير الشريطي المتعدد للعلماء بفهم البيئة المكروية للورم بشكل أفضل ، والتوزيع الخاص داخل الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تعطينا معلومات أكثر تفصيلا من نفس عينة الأنسجة مع إمكانية إجراء تنميط ظاهري أعمق للخلايا الفردية. مكنت هذه الطريقة اللوحات القابلة للتخصيص من دراسة البيئة المكروية للورم لاكتشاف العلامات الحيوية التنبؤية في الأنسجة السرطانية لاستخدامها كعلاج مستهدف جديد.
لبدء تلطيخ الأجسام المضادة المترافقة قليل النوكليوتيد ، انقع الغطاء في محلول 0.1٪ Poly-L-Lysine لمدة 24 ساعة ، في درجة حرارة الغرفة لإعدادها لوضع الأنسجة والالتصاق. بعد تصريف محلول Poly-L-Lysine ، اغسل انزلاق الغطاء بماء عالي النقاء لمدة 30 ثانية. بعد الغسيل ، قم بإزالة زلات الغطاء من الماء عالي النقاء وضعها على منشفة خالية من النسالة لتجف طوال الليل.
ضع أقساما بسمك 5 ميكرون من الأنسجة ذات الأهمية في وسط زلة غطاء مشحونة من Poly-L-Lysine ، واتركها تجف طوال الليل. سخني حامل انزلاق الغطاء في فرن على حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل. ضع قسيمة الغطاء التي تحتوي على أقسام الأنسجة في الحامل المسخن مسبقا.
بعد خبزه على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تحقق للتأكد من ذوبان البارافين بعيدا عن الأنسجة. ضع حامل انزلاق الغطاء الذي يحتوي على العينة بالتتابع بسرعة ، في سلسلة من الحلول. أخيرا ، ضع حامل انزلاق الغطاء في ماء فائق النقاء معالج ب DEPC لمدة جولتين مدة كل منهما خمس دقائق.
قم بإعداد غرفة الرطوبة عن طريق وضع منشفة ورقية مبللة بالماء في الجزء السفلي من صندوق طرف ماصة فارغ. املأ قدر الضغط بالماء ، وهو ما يكفي لتغطية نصف ارتفاع دورق سعة 50 ملليلتر. ضع 5 ملليلترات من الميثانول لكل عينة في كأس زجاجية عند 4 درجات سلزية.
قم بتخفيف الحجم المطلوب من المخزن المؤقت AR9 إلى 1X باستخدام ثنائي إيثيل بيروكربونات ، أو ماء عالي النقاء معالج ب DEPC. بعد ذلك ، املأ دورقا زجاجيا سعة 50 ملليلترا بحوالي 40 ملليلترا من المخزن المؤقت AR9 المخفف. اغمر العينة في حامل انزلاق الغطاء في الدورق ، وقم بتغطية الدورق بالكامل بورق الألمنيوم.
ضع الدورق المغطى بورق الألمنيوم في قدر الضغط المملوء بالماء ، واطهيه في حوالي 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة. ثم قم بإزالة الدورق وفك غلاف ورق الألمنيوم بعناية. اترك الكأس لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبا.
قم بإزالة حامل انزلاق الغطاء من المخزن المؤقت 1X AR9. احتضانه مرتين في ماء عالي النقاء معالج من قبل DEPC لمدة دقيقتين. وفي الوقت نفسه ، استرجع المخزن المؤقت للترطيب ، ومخفف الأجسام المضادة ، ومحاليل الحجب N و G و J و S من مجموعة تلطيخ التصوير المتعددة.
ضع عينة انزلاق الغطاء في 5 ملليلتر من المخزن المؤقت للترطيب مرتين ، لمدة دقيقتين لكل منهما. ثم ضع عينة انزلاق الغطاء في 5 ملليلتر من كتلة مخفف الأجسام المضادة للتصوير المتعدد واحتضانها لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة.
بعد الحضانة ، ضع زلة الغطاء في غرفة الرطوبة المعدة مسبقا. ماصة 190 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة على عينة انزلاق الغطاء ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك ، اغسل العينة مرتين ، كل منهما يحتوي على 5 ملليلتر من كتلة مخفف الأجسام المضادة للتصوير المتعدد لمدة دقيقتين.
لإصلاح الأجسام المضادة المرتبطة بالأنسجة ، احتضان زلات الغطاء لمدة 10 دقائق في 16 ٪ الفورمالديهايد المخفف إلى 1.6 ٪مع محلول التخزين ، وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. بعد احتضان الغطاء ينزلق لمدة خمس دقائق في الميثانول ، قبل التبريد إلى 4 درجات مئوية. بعد الغسيل ، احتضان انزلاق الغطاء مرة أخرى لمدة 20 دقيقة ، في 5 ملليلتر من الكاشف المثبت المخفف باستخدام PBS ، واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS قبل التخزين.
قم بإعداد المزيج الرئيسي للمراسل باتباع التكوين المذكور في النص. املأ بئرا في صفيحة من 96 بئرا ب 245 ميكرولترا من محلول يحتوي على المزيج الرئيسي للمراسل والفلوروفورات المحددة ذات الرمز الشريطي لتلك الدورة التجريبية. يوضح الشكل تكوين لوحة مراسل مستخدمة هنا للوحة سرطانية.
لحماية الفلوروفورات المشفرة بالباركود ، قم بلصق غطاء لوحة رقائق معدنية فوق لوحة المراسل المكونة من 96 بئرا ، وضع اللوحة داخل أداة التصوير متعددة الإرسال. قم بمعايرة تركيز التصوير باستخدام قناة DAPI عن طريق وضع زلة غطاء عينة على مرحلة المجهر وسحب 700 ميكرولتر يدويا من معايرة 1: 1500 لمحلول بقعة نووية على الأنسجة. لتحضير أداة التصوير متعددة الإرسال ، قم بتخفيف المخزن المؤقت للتصوير المتعدد 10X إلى 1X باستخدام الماء عالي النقاء المعالج بواسطة DEPC ، واملأ زجاجات الكاشف بالمحاليل أو المذيبات المناسبة.
اضبط جميع معلمات المجهر ، وحدد مناطق الاهتمام على قسيمة غطاء العينة المراد تصويرها. أدخل التصميم التجريبي في برنامج مدير الأدوات. انقر فوق الزر تجربة في برنامج التحكم، وفي نافذة إعداد التجربة وإدارتها، انقر فوق الزر قالب جديد.
اكتب اسم المشروع في المساحة المجاورة للزر، وأدخل العدد الإجمالي للدورات. انقر فوق الزر "تعيين القناة" ، واكتب المعلومات الخاصة بكل دورة في الأعمدة ، مثل الدورة الصحيحة ، وأرقام الآبار ، وأماكن Z-stack ، واسم العلامة ، والفئة ، ووقت التعرض لكل دورة. ثم ابدأ التجربة بالنقر على بدء التجربة، واحفظ التجربة.
انقر فوق رمز QuPath على الكمبيوتر ، وافتح البرنامج. اسحب ملف qptiff إلى نافذة العارض. انقر فوق زر السطوع والتباين لفتح نافذة تباين السطوع.
حدد العلامة أو قم بإلغاء تحديدها في العمود المحدد لإظهار إشارة العلامة أو إخفائها. انقر فوق الزر تكبير / تصغير للملاءمة لتكبير أو تصغير منطقة الاهتمام. عند عرضها باستخدام برنامج تحليل الصور ، أظهرت الصور المركبة جميع العلامات أو العلامات المحددة حسب الرغبة.
تم الكشف عن شدة الإشارة والنطاق الديناميكي والتوزيع المكاني لجميع العلامات. سمحت هذه التقنية بتحليل جميع العلامات ال 26 على المستوى تحت الخلوي في قسم نسيج واحد. بعد عملية تحليل الصور المتعددة ، من خلال الأساليب المعلوماتية ، يمكن معالجة وتحليل بيانات الخلية المفردة عالية الأبعاد لاستنتاج البصيرة البيولوجية والسريرية.
يعد تحليل صور التشفير الشريطي المتعدد منهجية قوية تمكن العلماء من تحديد سمات أنسجة الورم والإجابة على سؤال بحثهم وفقا للعلامات الموجودة في اللوحات.
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة بروتوكول تلوين وتصوير يستخدم تحليل صورة الباركود المتعدد لتعزيز توصيف بيئة الورم المكروية. تسمح الطريقة بدراسات مفصلة لتكوين الخلايا وحالاتها الوظيفية والتفاعلات داخل الأورام.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- علم الأورام
الخلفية
- تحليل صورة الباركود المتعدد يحسن استخراج المعلومات البيولوجية.
- يسمح بتصوير أعمق للخلايا الفردية.
- تستطيع هذه الطريقة تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية في أنسجة السرطان.
- تعزز اللوحات القابلة للتخصيص دراسة بيئات الأورام المكروية.
غرض الدراسة
- لتطوير بروتوكول لتلوين الأجسام المضادة المقترنة بالأوليغونوكليوتيدات.
- لتسهيل تحليل الصور عاليَ الأبعاد لعينات الأورام.
- لتحسين فهم تفاعلات الخلايا في بيئة الورم المكروية.
الطرق المستخدمة
- إعداد شرائح التغطية مع Poly-L-Lysine لتصاق الأنسجة.
- المعالجة التسلسلية لعينات الأنسجة بحلول مختلفة.
- الحضانة مع خليط الأجسام المضادة وتثبيت الأجسام المضادة المرتبطة.
- استخدام أدوات التصوير المتعدد لتحليل عاليَ الأبعاد.
النتائج الرئيسية
- نجاح تلوين وتصوير بيئات الأورام المكروية.
- معلومات مفصلة عن تكوين الخلايا والتفاعلات تم الحصول عليها.
- قدرة محسنة على تحليل عدة مؤشرات في وقت واحد.
- إمكانية تحديد أهداف جديدة لعلاج السرطان.
الاستنتاجات
- يسمح البروتوكول بتحليل شامل لعينات الأورام.
- الباركود المتعدد يعزز بشكل كبير ثراء البيانات.
- يمكن أن تؤدي هذه الطريقة إلى تقدم في أبحاث السرطان وعلاجه.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Multiplexed barcoding image analysis enables high-dimensional immunoprofiling and spatial mapping at single-cell resolution in paraffin tissue samples, directly addressing the challenge of tumor microenvironment characterization. This technology supports deeper phenotyping and spatial context, enhancing predictive confidence for biomarker discovery and target validation in oncology portfolios. Its compatibility with diverse sample types and preservation of tissue integrity position it as a reusable, enterprise-scale capability for translational research and discovery-stage decision making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of tumor microenvironmental pathways and cell phenotypes.
- Supports functional target validation by mapping protein expression at single-cell resolution.
- Facilitates predictive biomarker identification for oncology target triage.
- Reduces mechanistic ambiguity by integrating spatial and phenotypic data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream multiplexed screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible marker expression data across customizable antibody panels.
- Enables assay standardization and scalability for high-content screening platforms.
- Supports reliable compound evaluation by preserving sample integrity for additional analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial biomarker mapping with disease-relevant tissue architecture.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting downstream histological analysis.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on high-content, spatially resolved data.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker strategies in oncology.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed imaging method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and translational continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of tumor microenvironment and cell-cell interactions.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative multiplexed outputs for downstream workflows.
- Analytics: Delivers high-dimensional, spatially resolved measurements for robust condition comparison and clustering.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models via preserved tissue and spatial biomarker mapping.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, customizable platform for repeated use across diverse tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by integrating spatial and phenotypic data.
- Operational Value: Standardizes multiplexed imaging workflows and enables reproducibility at scale.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed immunostaining and high-content image analysis.
- Needs access to automated staining fluidics instruments and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of antibody panels and imaging protocols.
- Adaptable to various tissue types, including FFPE, fresh frozen, and cultured cells.
- Sample preservation enables additional downstream analyses, but throughput may be limited by imaging cycle duration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:01
Oligonucleotide‐Conjugated Antibody Staining
4:39
Multiplexed Imaging Reporter Plate
5:16
Operating the Multiplexed Imaging Machine
6:31
Multiplex Image Collection and Analysis
7:01
Results: Visualization of the Acquired Multiplexed Images
7:28
Conclusion
