تحليل صورة التشفير الشريطي المتعدد للتنميط المناعي وتوصيف الخرائط المكانية في تحليل الخلية الواحدة لعينات أنسجة البارافين

يسمح الحجم الكبير للمعلومات البيولوجية التي يتم الحصول عليها من تحليل صور التشفير الشريطي المتعدد للعلماء بفهم البيئة المكروية للورم بشكل أفضل ، والتوزيع الخاص داخل الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تعطينا معلومات أكثر تفصيلا من نفس عينة الأنسجة مع إمكانية إجراء تنميط ظاهري أعمق للخلايا الفردية. مكنت هذه الطريقة اللوحات القابلة للتخصيص من دراسة البيئة المكروية للورم لاكتشاف العلامات الحيوية التنبؤية في الأنسجة السرطانية لاستخدامها كعلاج مستهدف جديد.

لبدء تلطيخ الأجسام المضادة المترافقة قليل النوكليوتيد ، انقع الغطاء في محلول 0.1٪ Poly-L-Lysine لمدة 24 ساعة ، في درجة حرارة الغرفة لإعدادها لوضع الأنسجة والالتصاق. بعد تصريف محلول Poly-L-Lysine ، اغسل انزلاق الغطاء بماء عالي النقاء لمدة 30 ثانية. بعد الغسيل ، قم بإزالة زلات الغطاء من الماء عالي النقاء وضعها على منشفة خالية من النسالة لتجف طوال الليل.

ضع أقساما بسمك 5 ميكرون من الأنسجة ذات الأهمية في وسط زلة غطاء مشحونة من Poly-L-Lysine ، واتركها تجف طوال الليل. سخني حامل انزلاق الغطاء في فرن على حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل. ضع قسيمة الغطاء التي تحتوي على أقسام الأنسجة في الحامل المسخن مسبقا.

بعد خبزه على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تحقق للتأكد من ذوبان البارافين بعيدا عن الأنسجة. ضع حامل انزلاق الغطاء الذي يحتوي على العينة بالتتابع بسرعة ، في سلسلة من الحلول. أخيرا ، ضع حامل انزلاق الغطاء في ماء فائق النقاء معالج ب DEPC لمدة جولتين مدة كل منهما خمس دقائق.

قم بإعداد غرفة الرطوبة عن طريق وضع منشفة ورقية مبللة بالماء في الجزء السفلي من صندوق طرف ماصة فارغ. املأ قدر الضغط بالماء ، وهو ما يكفي لتغطية نصف ارتفاع دورق سعة 50 ملليلتر. ضع 5 ملليلترات من الميثانول لكل عينة في كأس زجاجية عند 4 درجات سلزية.

قم بتخفيف الحجم المطلوب من المخزن المؤقت AR9 إلى 1X باستخدام ثنائي إيثيل بيروكربونات ، أو ماء عالي النقاء معالج ب DEPC. بعد ذلك ، املأ دورقا زجاجيا سعة 50 ملليلترا بحوالي 40 ملليلترا من المخزن المؤقت AR9 المخفف. اغمر العينة في حامل انزلاق الغطاء في الدورق ، وقم بتغطية الدورق بالكامل بورق الألمنيوم.

ضع الدورق المغطى بورق الألمنيوم في قدر الضغط المملوء بالماء ، واطهيه في حوالي 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة. ثم قم بإزالة الدورق وفك غلاف ورق الألمنيوم بعناية. اترك الكأس لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبا.

قم بإزالة حامل انزلاق الغطاء من المخزن المؤقت 1X AR9. احتضانه مرتين في ماء عالي النقاء معالج من قبل DEPC لمدة دقيقتين. وفي الوقت نفسه ، استرجع المخزن المؤقت للترطيب ، ومخفف الأجسام المضادة ، ومحاليل الحجب N و G و J و S من مجموعة تلطيخ التصوير المتعددة.

ضع عينة انزلاق الغطاء في 5 ملليلتر من المخزن المؤقت للترطيب مرتين ، لمدة دقيقتين لكل منهما. ثم ضع عينة انزلاق الغطاء في 5 ملليلتر من كتلة مخفف الأجسام المضادة للتصوير المتعدد واحتضانها لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة.

بعد الحضانة ، ضع زلة الغطاء في غرفة الرطوبة المعدة مسبقا. ماصة 190 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة على عينة انزلاق الغطاء ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك ، اغسل العينة مرتين ، كل منهما يحتوي على 5 ملليلتر من كتلة مخفف الأجسام المضادة للتصوير المتعدد لمدة دقيقتين.

لإصلاح الأجسام المضادة المرتبطة بالأنسجة ، احتضان زلات الغطاء لمدة 10 دقائق في 16 ٪ الفورمالديهايد المخفف إلى 1.6 ٪مع محلول التخزين ، وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. بعد احتضان الغطاء ينزلق لمدة خمس دقائق في الميثانول ، قبل التبريد إلى 4 درجات مئوية. بعد الغسيل ، احتضان انزلاق الغطاء مرة أخرى لمدة 20 دقيقة ، في 5 ملليلتر من الكاشف المثبت المخفف باستخدام PBS ، واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS قبل التخزين.

قم بإعداد المزيج الرئيسي للمراسل باتباع التكوين المذكور في النص. املأ بئرا في صفيحة من 96 بئرا ب 245 ميكرولترا من محلول يحتوي على المزيج الرئيسي للمراسل والفلوروفورات المحددة ذات الرمز الشريطي لتلك الدورة التجريبية. يوضح الشكل تكوين لوحة مراسل مستخدمة هنا للوحة سرطانية.

لحماية الفلوروفورات المشفرة بالباركود ، قم بلصق غطاء لوحة رقائق معدنية فوق لوحة المراسل المكونة من 96 بئرا ، وضع اللوحة داخل أداة التصوير متعددة الإرسال. قم بمعايرة تركيز التصوير باستخدام قناة DAPI عن طريق وضع زلة غطاء عينة على مرحلة المجهر وسحب 700 ميكرولتر يدويا من معايرة 1: 1500 لمحلول بقعة نووية على الأنسجة. لتحضير أداة التصوير متعددة الإرسال ، قم بتخفيف المخزن المؤقت للتصوير المتعدد 10X إلى 1X باستخدام الماء عالي النقاء المعالج بواسطة DEPC ، واملأ زجاجات الكاشف بالمحاليل أو المذيبات المناسبة.

اضبط جميع معلمات المجهر ، وحدد مناطق الاهتمام على قسيمة غطاء العينة المراد تصويرها. أدخل التصميم التجريبي في برنامج مدير الأدوات. انقر فوق الزر تجربة في برنامج التحكم، وفي نافذة إعداد التجربة وإدارتها، انقر فوق الزر قالب جديد.

اكتب اسم المشروع في المساحة المجاورة للزر، وأدخل العدد الإجمالي للدورات. انقر فوق الزر "تعيين القناة" ، واكتب المعلومات الخاصة بكل دورة في الأعمدة ، مثل الدورة الصحيحة ، وأرقام الآبار ، وأماكن Z-stack ، واسم العلامة ، والفئة ، ووقت التعرض لكل دورة. ثم ابدأ التجربة بالنقر على بدء التجربة، واحفظ التجربة.

انقر فوق رمز QuPath على الكمبيوتر ، وافتح البرنامج. اسحب ملف qptiff إلى نافذة العارض. انقر فوق زر السطوع والتباين لفتح نافذة تباين السطوع.

حدد العلامة أو قم بإلغاء تحديدها في العمود المحدد لإظهار إشارة العلامة أو إخفائها. انقر فوق الزر تكبير / تصغير للملاءمة لتكبير أو تصغير منطقة الاهتمام. عند عرضها باستخدام برنامج تحليل الصور ، أظهرت الصور المركبة جميع العلامات أو العلامات المحددة حسب الرغبة.

تم الكشف عن شدة الإشارة والنطاق الديناميكي والتوزيع المكاني لجميع العلامات. سمحت هذه التقنية بتحليل جميع العلامات ال 26 على المستوى تحت الخلوي في قسم نسيج واحد. بعد عملية تحليل الصور المتعددة ، من خلال الأساليب المعلوماتية ، يمكن معالجة وتحليل بيانات الخلية المفردة عالية الأبعاد لاستنتاج البصيرة البيولوجية والسريرية.

يعد تحليل صور التشفير الشريطي المتعدد منهجية قوية تمكن العلماء من تحديد سمات أنسجة الورم والإجابة على سؤال بحثهم وفقا للعلامات الموجودة في اللوحات.