استجواب مزدوج خاص بالخلية ل Epigenome المبيض للفأر و Transcriptome

توفر هذه الطريقة تقنية لعزل الأحماض النووية من مجموعات معينة من خلايا المبيض من نفس الفأر دون الحاجة إلى فرز الخلايا. يمكن أن تساعد هذه التقنية في تحديد كيفية تغير مجموعات خلايا معينة في ظل مجموعة متنوعة من الظروف. على سبيل المثال ، مع الشيخوخة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتحليل الجيني والنسخ المزدوج من نوع معين من خلايا المبيض دون الحاجة إلى فرز الخلايا. هذا يزيد بشكل كبير من الإنتاجية ، ويقلل من التكلفة ، ويلغي الحاجة إلى معدات متخصصة عند إجراء تحليل خاص بنوع الخلية من أنسجة المبيض. هنا ، هدفنا هو تحديد التغيرات الخاصة بنوع الخلية التي تحدث مع شيخوخة المبيض قبل الشيخوخة الإنجابية ، والتي لها آثار في علاج العقم عند النساء.

يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نوع من الخلايا عبر أنظمة الجسم التي يتوفر لها برنامج تشغيل Cre خاص بنوع الخلية. أصعب جزء في هذه التقنية هو اختيار خط Cre مناسب لنوع الخلية التي تهمك. يوصى بالتحقق الشامل من خصوصية الخلية.

للبدء ، اجمع مبيضا واحدا من الفأر الرحيم في 500 ميكرولتر من محلول تحلل النوى واقطع المبيض إلى ثمانية أجزاء داخل المخزن المؤقت باستخدام مقص دقيق ذاتي الفتح. انقل المبيض المفروم ومخزن التحلل إلى خالط زجاجي على الجليد وقم بتجانس المبيض من 10 إلى 20 مرة باستخدام المدقة السائبة A.أضف 400 ميكرولتر من محلول التحلل إلى مدقة غسيل الخالط dounce A.ثم قم بتجانس المبيض بمدقة ضيقة B من 10 إلى 20 مرة. انقل المجانس إلى أنبوب قاعي دائري سعة 2 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 200 جم لمدة 1.5 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة الأنسجة والأوعية الدموية غير المنفصلة.

بعد ترطيب مصفاة خلية 30 ميكرومتر مسبقا مع 100 ميكرولتر من محلول التحلل ، قم بتصفية المادة الطافية من خلال المصفاة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. انقل النوى التي تحتوي على خليط إلى أنبوب دائري القاع حجمه 2 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي العينة عند 500 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق حبيبات النوى في 250 ميكرولتر من محلول تحلل الجليد البارد عن طريق الدوامة لفترة وجيزة بسرعة معتدلة إلى عالية. ارفع مستوى الصوت إلى 1.75 ملليلتر بإضافة 1.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل. امزج بلطف وضع تعليق النوى على الثلج لمدة خمس دقائق.

بيليه النوى عن طريق الطرد المركزي عند 500 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. وتخلص بعناية من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات النوى. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من مخزن تخزين الثلج البارد والدوامة لفترة وجيزة لإعادة تعليق حبيبات النوى تماما.

احتفظ بنسبة 10٪ من الحبيبات المعاد تعليقها كعينة من نوى الإدخال لتحليل المصب. خذ منصة نقالة النوى المعاد تعليقها وقم بتكوين الحجم إلى ملليلتر مع مخزن تنقية نووي بارد بالجليد ، أو NPB. أضف 30 ميكرولترا من الخرز المعاد تعليقه لكل عينة في أنبوب دائري القاع سعة 2 ملليلتر.

ثم أضف ملليلتر واحد من NPB وأعد تعليقه جيدا عن طريق الماصة. ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة لفصل الخرز. تخلص من المادة الطافية وأخرج الأنبوب من المغناطيس.

أعد تعليق الخرزات المغناطيسية المغسولة في ملليلتر واحد من NPB. كرر خطوة الغسيل لما مجموعه ثلاث غسلات. وبعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخرز في الحجم الأولي من NPB.

أضف 30 ميكرولترا من الخرزات المغسولة إلى ملليلتر من المعلق النووي وأعد تعليق خليط نوى الخرز جيدا عن طريق سحب الأنبوب وقلبه برفق. ضع الأنابيب على خلاط دوار في غرفة باردة أو ثلاجة لمدة 30 دقيقة بسرعة منخفضة واحتضان عينات الإدخال بدون خرز في نفس الظروف. ضع الأنابيب مع تعليق النوى والخرز على المغناطيس لمدة ثلاث دقائق لفصل النوى البيوتينلية المرتبطة بخرز الستربتافيدين عن الجزء السالب من النوى.

إزالة الطاف. مرر الكسر السالب إلى أنبوب جديد سعة 2 ملليلتر واحتفظ به على الجليد. لكل أنبوب كسر موجب ، قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس وأعد تعليق المحتويات في ملليلتر واحد من NPB.

ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق خليط نوى حبة الكسر الموجب في 30 ميكرولتر من NPB. انقل المبيض و 100 ميكرولتر من محلول التجانس إلى خالط داند زجاجي وقم بالتجانس من 10 إلى 20 مرة باستخدام المدقة السائبة A.أضف 400 ميكرولتر من محلول التجانس TRAP إلى مدقة الغسيل A وانقل التجانس إلى أنبوب سفلي دائري سعة 2 ملليلتر.

اغسل الخالط بملليلتر إضافي واحد من المخزن المؤقت للتجانس TRAP وانقل الحجم المغسول إلى الأنبوب السفلي المستدير سعة 2 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي المجانسة في 12،000 غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. وانقل المادة الطافية التي تم تطهيرها إلى أنبوب سفلي دائري جديد سعة 2 ملليلتر.

بعد التخلص من الحبيبات ، انقل 100 ميكرولتر من التجانس الذي تم تطهيره إلى أنبوب قاعي دائري جديد سعة 2 ملليلتر واحتفظ به كمدخل على الجليد. احتضن ما تبقى من التجانس الذي تم تطهيره بخمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من الجسم المضاد ل GFP لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية أثناء الدوران في خلاط طرفي. احتضان عينة الإدخال في نفس الحالة.

انقل 50 ميكرولترا من حبات البروتين G المغناطيسية لكل عينة إلى أنبوب دائري القاع سعة 2 ملليلتر. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل قليل الملح إلى الخرز والماصة برفق للخلط. ضع الأنبوب في حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة لجمع الخرزات على جانب الأنبوب.

بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي وأضف ملليلتر واحد من محلول الغسيل قليل الملح إلى الأنبوب. ماصة بلطف لخلط. مرة أخرى ، ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي وكرر الخطوة لما مجموعه ثلاث غسلات.

بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخرز في الحجم الأولي للمخزن المؤقت للغسيل قليل الملح. انقل الخرزات المغسولة المعاد تعليقها إلى خليط الأجسام المضادة لعينة المستضد واحتضانها عند أربع درجات مئوية طوال الليل أثناء الدوران في خلاط طرفي. احتضان عينات الإدخال بين عشية وضحاها في الظروف المكافئة.

بعد ذلك ، افصل الجزء الموجب أو الخرزات المغناطيسية مع الريبوسومات المستهدفة RNA عن الجزء السالب أو المادة الطافية باستخدام الحامل المغناطيسي لمدة 2.5 إلى 3 دقائق. نضح الكسر السالب. ضعه في أنبوب سفلي دائري جديد سعة 2 ملليلتر ، وضعه جانبا على الثلج.

أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل عالي الملح إلى الأنبوب مع الجزء الموجب وماصة بلطف للخلط. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي يتم الاحتفاظ به على الثلج لمدة دقيقة واحدة لفصل الخرز. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس وكرر الخطوة لما مجموعه ثلاث غسلات.

بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الخرزات في 350 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي الريبي المكمل ب 3.5 ميكرولتر من 2-ميركابتوإيثانول. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة أثناء الخلط لمدة 10 دقائق عند 900 دورة في الدقيقة في شاكر رقمي. افصل الخرزات عن المحلول الذي يحتوي الآن على الريبوسومات المستهدفة RNA مع حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

اجمع الكسر الموجب المستحضر في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. تم إجراء التصوير المناعي على المبايض البارافينية لفئران Cyp17-Cre الإيجابية NuTRAP flox و Cyp17-Cre السلبية NuTRAP flox. تم تلطيخ بروتين EGFP باستخدام الجسم المضاد الأولي للماعز المضاد ل GFP والجسم المضاد الثانوي للحمار Alexa 488 ، وتم تلطيخ النوى ب DAPI.

تم التقاط الصور على مجهر مضان عند تكبير 20x. تم عزل المدخلات والحمض النووي الريبي للجزء الإيجابي TRAP من مبايض فلوكس الفأر NuTRAP flox الإيجابية Cyp17-Cre وتسلسلها بطريقة نهاية مزدوجة. أظهر تحليل المكون الرئيسي لجميع الجينات المعبر عنها فصلا بين مدخلات TRAP والكسور الموجبة في المكون الأول.

يوضح هنا مخطط البركان للجينات المعبر عنها تفاضليا بين الكسور المدخلة والموجبة. أظهرت مقارنة الجزء الإيجابي TRAP مع المدخلات إثراء عاما لجينات علامة خلية السدى / الثيكا واستنفاد جينات علامة الخلايا البويضية والحبيبية والمناعية والملساء في الجزء الإيجابي TRAP. بعد الطرد المركزي الأول للتعليق النووي لإزالة الأوعية الدموية غير المنفصلة ، تكون النوى في المادة الطافية.

تأكد من الاحتفاظ بالمادة الطافية وتخلص من الحبيبات في هذه المرحلة. باتباع الطريقة السليمة ، يمكن إجراء العديد من التقنيات فوق الجينية ، بما في ذلك فحوصات إمكانية الوصول إلى الكروماتين أو تعديلات الحمض النووي وغيرها. باتباع طريقة TRAP ، يمكن إجراء تسلسل RT-qCPR أو RNA لتقييم الترجمة.

هذا هو التطبيق الأول لطريقة NuTRAP في مبيض الفأر. وهذا يسمح بإجراء تحليل فوق جيني ونسخي عالي الإنتاجية من أنواع معينة من خلايا المبيض ، والتي يمكن استخدامها لدراسة شيخوخة المبيض أو السرطان.