تصور المستقلبات المحددة في الأيض المكاني للطب الصيني التقليدي باستخدام DESI-MSI

تصف هذه المقالة بشكل أساسي طريقة فعالة من حيث التكلفة لإعداد عينات النبات والتصوير باستخدام DESI-MSI ، ويمكن أن تتغلب على العيوب المرتبطة بالأنسجة الجافة ، والتي تنكسر بسهولة عندما ينفخ النيتروجين. تم تشريح الجذر بالتبريد على ميكروتوم cryostat ، في حين تم تحضير الورقة عن طريق البصمة ، الأمر الذي يتطلب آلة باهظة الثمن أو يفقد شدة الإشارة. يمكن لطريقتنا التغلب على هذه القيود.

يمكن استخدام هذه الطريقة في الأيض المكاني للنباتات مثل توزيع وحركة المواد السامة في النباتات تحت الضغط اللاأحيائي والحيوي. للبدء ، خذ الجذور والأوراق النظيفة من نبات salvia miltiorrhiza البالغ من العمر عامين وقم بتقطيعه مباشرة بسمك مقطع عرضي يبلغ حوالي ثلاثة إلى خمسة ملليمترات. بعد ذلك ، قم بلصق العينة على شريحة زجاجية مجهر التصاق باستخدام شريط على الوجهين.

ضع شريحة زجاجية مجهرية أخرى فوق العينة ولفها بغشاء مانع للتسرب مثل شطيرة. بعد ذلك ، قم بتجميد عينة الساندويتش عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة أربع ساعات على الأقل ، ثم قم بتعريضها لفراغ هوائي لمدة ساعتين مع درجة الحرارة المحبوسة عند 75 إلى 82 درجة مئوية تحت الصفر ومقياس الفراغ عند 2.5 إلى 3.7 باسكال. للتحليل ، بعد إزالة العينات من غرفة التبريد ، قم بإحضارها إلى درجة حرارة الغرفة في مجفف لتجنب التكثيف على سطح العينة قبل إخضاع العينة لتطبيق المصفوفة.

قم بتنفيذ إعداد كاشف الأدوات ومعايرة الكتلة في التأين بالرش الكهربائي أو وضع ESI. قم بإجراء إعداد الكاشف باستخدام الليوسين والسيفالين في أسيتونيتريل الماء بنسبة واحد إلى واحد ، وقم بإجراء معايرة الكتلة باستخدام فورمات الصوديوم وأيزوبروبانول الماء بنسبة واحد إلى واحد. أخرج مصدر ESI وقم بتركيب وحدة DESI على مطياف الكتلة.

قم بتوصيل مصدر غاز النيتروجين بوحدة DESI واضبط ضغط الغاز على حوالي 0.5 ميجاباسكال. املأ حقنة سعة خمسة ملليلتر بالليوسين والسيفالين وحمض الفورميك في ميثانول الماء بنسبة واحد إلى تسعة ، وقم بتوصيل المحقنة بمضخة المحقنة عالية الأداء لتوفير مذيب لتأين المواد الكيميائية في العينة. بعد ذلك ، قم بتوصيل شعري يوفر المذيبات بالمحقنة وبخاخ DESI.

المذيب الذي يوفر الشعيرات الدموية هو شعيرات دموية قياسية ذات أبعاد يبلغ قطرها الداخلي 75 ميكرومتر وقطرها الخارجي 375 ميكرومتر. ابدأ تشغيل مضخة المحقنة واضبط معدل التسريب على 2 ميكرولتر في الدقيقة للحصول على تدفق مستمر ورذاذ المذيب. قم بإيقاف تشغيل صمام غاز النيتروجين ثم قم بتشغيله بعد حوالي 15 ثانية.

تنفجر قطرة صغيرة من المذيب على المسرح ويمكن رؤية الرذاذ إذا كان تدفق المذيب في حالة ثابتة. بعد ذلك ، اضبط موضع البخاخ من حيث زاوية الرش ومحور XYZ والنتوء والارتفاع. استخدم علامات حمراء وسوداء كمراجع لتحسين إشارة قياس الطيف الكتلي للحصول على شدة إشارة تبلغ حوالي واحد في 10 إلى الخامس في وضع الحساسية.

نظرا لأن نتوء البخاخ هو العامل الأكثر أهمية الذي يؤثر على شدة الإشارة ، اضبط النتوء عن طريق تغيير واقي غاز النيتروجين باستخدام مفتاح ربط خمسة ملليمترات. يؤثر اتجاه الرش على جودة الصورة الجماعية. ومن ثم ، قم بتدوير البخاخ حتى يصبح الرذاذ مستقيما.

بعد كل هذه الخطوات ، يكون الإعداد جاهزا للتجارب وعادة ما يكون مستقرا لمدة ثلاثة أسابيع تقريبا من قابلية الاستخدام بعد الإعداد الأولي. بالنسبة لتصوير DESI-MS ، لا يلزم إجراء معالجة مسبقة للعينة. ومع ذلك ، قم بإزالة الوسائط الزائدة على الشرائح إن أمكن.

التقط صورة للعينة على الشريحة. دون لمس سطح العينة لتجنب أي شوائب ، ضع الشريحة على موضع اللوحة على مرحلة DESI ، والتي تحتوي على موقعين للوحة ، A و B.استخدم الشرائح القياسية أو شريحة كاملة لتناسب الموضع. يمكن أن تستوعب الشريحة الكاملة ما يصل إلى أربع شرائح وبالتالي تحتوي على مساحة أكبر بكثير للتجارب.

افتح برنامج معالجة الصور الجماعية عالي الوضوح. قم بتعيين لوحة جديدة في علامة التبويب Acquisition ، وحدد موضع اللوحة الأيمن ، A أو B ، ونوع اللوحة. في الصفحة تحديد صورة، حدد الزوايا الأربع للشريحة، ثم يتم ضبط الصورة تلقائيا على الاتجاه الصحيح.

لتعيين معلمات MS ، حدد نوع التجربة كوضع DESI-MS الذي يشيع استخدامه حيث سيتم اكتشاف الأيون الأصلي فقط. بعد ذلك ، حدد القطبية إما موجبة أو سالبة حيث يمكن للأداة استخدام قطبية واحدة فقط في التجربة. ثم قم بتطبيق وضع الحساسية للحصول على مزيد من المعلومات حول المواد الكيميائية بكميات صغيرة.

بعد ذلك ، ارسم مستطيلا لتحديد منطقة المسح الضوئي في علامة التبويب Pattern ، وقم بتعيين حجم البكسل عن طريق الحفاظ على أحجام X و Y للبكسل متساوية. اضبط معدل المسح على ما لا يزيد عن خمسة أضعاف حجم البكسل. احفظ المشروع وقم بتصدير ورقة عمل لبرنامج اكتساب MS.

بعد ذلك ، قم باستيراد ورقة العمل إلى برنامج اكتساب MS واحفظها كقائمة عينة جديدة. اضغط على Start Run لبدء مسح صور MS ، ويمكن إضافة صور متعددة إلى قائمة انتظار التجربة عن طريق استيراد المزيد من أوراق العمل. قم بتحميل ملف بيانات العينة في برنامج معالجة الصور الجماعية وقم بتعيين معلمات معالجة الصور DESI.

نظرا لاستخدام الليوسين والسيفالين لكتلة القفل الداخلية ، وكتلة القفل هي النقطة الوحيدة لتحديد قطبية التجربة ، فمن الأهمية بمكان ضبط كتلة القفل الصحيحة. اضبط 556.2772 للوضع الإيجابي و 554.2620 للوضع السلبي. لإنشاء قائمة بالمواد الكيميائية المستهدفة ، قم بتحميل ملف البيانات المعالج لتصور صورة DESI للعينة.

انقر فوق الزر "تطبيع" لتطبيع البيانات حسب اللوني الأيوني الكلي للحصول على الكثافة النسبية لمادة كيميائية معينة إلى المرجع ، ومن ثم يمكن مقارنة عينات مختلفة مع بعضها البعض. ارسم منطقة اهتمام أو عائد استثمار وانسخ عدة نسخ على نموذج الصورة. ثم حدد جميع عائد الاستثمار وقم بتصدير التحليل متعدد المتغيرات لاستخراج معلومات MS من جميع عائد الاستثمار.

يظهر تصوير قياس الطيف الكتلي لأقسام الجذر والورقة الكاملة التوزيع المكاني للمركبات المختارة. يمثل لون كل بكسل واحد الكثافة النسبية لنسبة الكتلة إلى الشحنة ، وبالتالي يمكن أن يرتبط بالتوزيع الطبيعي ووفرة أيون المستقلب في جميع أنحاء العينة. توزيع المركبات المستهدفة ، tanshinone IIA وحمض روزمارينيك ، مرئي في مناطق مختلفة من الجذر.

تم الكشف عن مركب tanshinol A في أقسام الأوراق كبروتوكول يهدف إلى التكاثر ، فإن أهم شيء هو تحسين شدة الإشارة عن طريق ضبط موضع البخاخ في عدة أبعاد.