Name: تحسين عائد التوبولين من أنسجة المخ الخنازير (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: تعلم عزل التوبولين بعائد عالٍ من أنسجة مخ الخنازير باستخدام الطرد المركزي والتجانس. تُحافظ هذه الطريقة على ديناميكيات البروتين الطبيعية لدراسة التفاعلات الخلوية وتصميم الأدوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>عزل فعال للتوبولين من الأنسجة العصبية

<ol><li>Verhey, K. J., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The tubulin code.</a> Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).</li>
<li>Murphy, D. B., Hiebsch, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+microtubule+protein+from+beef+brain+and+comparison+of+the+assembly+requirements+for+neuronal+microtubules+isolated+from+beef+and+hog%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of microtubule protein from beef brain and comparison of the assembly requirements for neuronal microtubules isolated from beef and hog.</a> Anal Biochem. 96 (1), 225-235 (1979).</li>
<li>Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+and+associated+high+molecular+weight+proteins+from+porcine+brain+and+characterization+of+microtubule+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro.</a> Ann NY Acad Sci. 253, 1 The Biology o 107-132 (1975).</li>
<li>Weisenberg, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+formation+in+vitro+in+solutions+containing+low+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations.</a> Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).</li>
<li>Roychowdhury, S., Gaskin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+assembly-competent+tubulin+from+brain+microtubule+protein+preparations+using+a+fast-performance+liquid+chromatography+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Separation of assembly-competent tubulin from brain microtubule protein preparations using a fast-performance liquid chromatography procedure.</a> J Neurochem. 46 (5), 1399-1405 (1986).</li>
<li>Weingarten, M. D., Suter, M. M., Littman, D. R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+depolymerization+products+of+microtubules+from+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Properties of the depolymerization products of microtubules from mammalian brain.</a> Biochemistry. 13 (27), 5529-5537 (1974).</li>
<li>Souphron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles.</a> Nat Protoc. 14 (5), 1634-1660 (2019).</li>
<li>Jacobs, M., Huitorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-associated+nucleoside+diphosphokinase%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tubulin-associated nucleoside diphosphokinase.</a> Eur J Biochem. 99 (3), 613-622 (1979).</li>
<li>Munguía, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+native+M.+vogae+and+H.+contortus+tubulin+by+TOG+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Purification of native M. vogae and H. contortus tubulin by TOG affinity chromatography.</a> Exp Parasitol. 182, 37-44 (2017).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+ExpPurif%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein ExpPurif. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Minoura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression%2C+purification%2C+and+functional+analysis+of+recombinant+human+tubulin+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer.</a> FEBS Lett. 587 (21), 3450-3455 (2013).</li>
<li>Liu, C., Yao, J., Yin, J., Xue, J., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+%CE%B1-+and+%CE%B2-tubulin+from+Echinococcus+granulosus%3A+Expression%2C+purification+and+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Recombinant α- and β-tubulin from Echinococcus granulosus: Expression, purification and polymerization.</a> Parasite. 25, 62(2018).</li>
<li>Ti, S. -C., Wieczorek, M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+affinity+tag-free+recombinant+tubulin+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of affinity tag-free recombinant tubulin from insect cells.</a> STAR protoc. 1 (1), 100011(2020).</li>
<li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+and+isotypes+from+limited+sources+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22JVisExp%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles.</a> JVisExp. (165), e61826(2020).</li>
<li>Sackett, D. L., Werbovetz, K. A., Morrissette, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+tubulin+from+nonneural+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolating tubulin from nonneural sources.</a> Methods Cell Biol. 95, 17-32 (2010).</li>
<li>Modig, C., Strömberg, E., Wallin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+stability+of+posttranslationally+modified+brain+microtubules+isolated+from+cold-temperate+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Different stability of posttranslationally modified brain microtubules isolated from cold-temperate fish.</a> Mol Cell Biochem. 130 (2), 137-147 (1994).</li>
<li>Fourest-Lieuvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+limited+volumes+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Exp+Purif%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from limited volumes of cultured cells.</a> Protein Exp Purif. 45 (1), 183-190 (2006).</li>
<li>MacRae, T. H., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+assembly+in+vitro+of+tubulin+from+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Purification and assembly in vitro of tubulin from Trypanosoma brucei.</a> Biochem J. 265 (1), 87-93 (1990).</li>
<li>Lazar, I. GelAnalyzer 19.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.gelanalyzer.com">www.gelanalyzer.com</a> (2024).</li>
<li>Jansen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+microtubule-associated+protein+2c+%28MAP2c%29+phosphorylation+and+regulatory+protein+14-3-3%CE%B6-binding+sites+reveals+key+differences+between+MAP2c+and+its+homolog+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22JBiol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of microtubule-associated protein 2c (MAP2c) phosphorylation and regulatory protein 14-3-3ζ-binding sites reveals key differences between MAP2c and its homolog Tau.</a> JBiol Chem. 292 (24), 3-3 (2017).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+microtubule+associated+proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of microtubule associated proteins Tau and MAP2c: Similarities and differences.</a> Biomolecules. 9 (3), E105(2019).</li>
<li>Herzog, W., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+brain+microtubule-associated+proteins%3A+Isolation+of+two+different+proteins+which+stimulate+tubulin+polymerization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of brain microtubule-associated proteins: Isolation of two different proteins which stimulate tubulin polymerization in vitro.</a> Eur J Biochem. 92 (1), 1-8 (1978).</li>
<li>Castle, A. G., Crawford, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+tubulin+from+pig+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isolation of tubulin from pig platelets.</a> FEBS Lett. 51 (1), 195-200 (1975).</li>
<li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> Int J Mol Sci. 18 (10), E2207(2017).</li>
<li>Lafanechère, L., Job, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+tubulin+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">The third tubulin pool.</a> Neurochem Res. 25 (1), 11-18 (2000).</li>
<li>Arai, T., Ihara, Y., Arai, K., Kaziro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+bovine+brain+and+its+interaction+with+guanine+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from bovine brain and its interaction with guanine nucleotides.</a> J Biochem. 77 (3), 647-658 (1975).</li>
<li>Mahaddalkar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigations+into+the+binding+mode+of+a+novel+noscapine+analogue%2C+9-%284-vinylphenyl%29+noscapine%2C+with+tubulin+by+biochemical+analyses+and+molecular+dynamic+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Structural investigations into the binding mode of a novel noscapine analogue, 9-(4-vinylphenyl) noscapine, with tubulin by biochemical analyses and molecular dynamic simulations.</a> J Biomol Struct Dyn. 35 (11), 2475-2484 (2017).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+study+of+novel+6-Aryl-2-benzoyl-pyridines+as+tubulin+polymerization+inhibitors+with+potent+antiproliferative+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship study of novel 6-Aryl-2-benzoyl-pyridines as tubulin polymerization inhibitors with potent antiproliferative properties.</a> J Med Chem. 63 (2), 827-846 (2020).</li>
<li>Yao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferulin+C+triggers+potent+PAK1+and+p21-mediated+anti-tumor+effects+in+breast+cancer+by+inhibiting+Tubulin+polymerization+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Ferulin C triggers potent PAK1 and p21-mediated anti-tumor effects in breast cancer by inhibiting Tubulin polymerization in vitro and in vivo.</a> Pharmacol Res. 152, 104605(2020).</li>
<li>Sweetnam, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptor+binding+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22JNat+Prod%22%5BJournal%5D)">The role of receptor binding in drug discovery.</a> JNat Prod. 56 (4), 441-455 (1993).</li>
<li>Qi, Z. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+1-%28benzofuran-3-yl%29-4-%283%2C4%2C5-trimethoxyphenyl%29-1H-1%2C2%2C3-triazole+derivatives+as+tubulin+polymerization+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of 1-(benzofuran-3-yl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazole derivatives as tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorg Chem. 94, 103392(2020).</li>
<li>Sáez-Calvo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triazolopyrimidines+are+microtubule-stabilizing+agents+that+bind+the+vinca+inhibitor+site+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Bio%22%5BJournal%5D)">Triazolopyrimidines are microtubule-stabilizing agents that bind the vinca inhibitor site of tubulin.</a> Cell Chem Bio. 24 (6), 737-750 (2017).</li>
<li>Bellocq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+assembly-competent+tubulin+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EurJ+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of assembly-competent tubulin from Saccharomyces cerevisiae.</a> EurJ Biochem. 210 (1), 343-349 (1992).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>أنابيب 1.5 مل</td> <td>---</td> <td>---</td> <td>مادة شائعة</td></tr><tr><td>أنابيب 10 مل</td> <td>---</td> <td>---</td> <td>مادة شائعة</td></tr><tr><td>أنابيب 50 مل</td> <td>---</td> <td>---</td> <td>مادة</td></tr><tr><td>شائعة ATP</td><td>ROTH</td><td>HN35.2</td><td>درجة تحليلية</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.2</td><td>درجة تحليلية</td></tr><tr><td>مجانس زجاجي</td><td>Dounce P-LAB</td><td>H244043</td><td>الخالط</td></tr><tr><td>DTT</td><td>ROTH</td><td>6908.1</td><td>الصف التحليلي</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td>الصف التحليلي</td></tr><tr><td>الإيثانول</td><td>PENTA</td><td>70390-11001</td><td>الدرجة التحليلية</td></tr><tr><td>الجلسرين</td><td>ROTH</td><td>6967.2</td><td>الصف التحليلي</td></tr><tr><td>أكواب</td> <td>--- ---</td><td></td> <td>المعدات الشائعة</td></tr><tr><td>الألواح المتدرجة</td> <td>---</td><td>---</td><td>المعدات الشائعة</td></tr><tr><td>GTP</td><td>MERCK</td><td>36051-31-7</td><td>جودة عالية جدا</td></tr><tr><td>HCl</td><td>PENTA</td><td>19360-11000</td> صندوق Izolated <td>من الدرجة التحليلية</td></tr><tr><td>لنقل</td> <td>الأنسجة ---</td> <td>---</td> <td>المعدات الشائعة</td></tr><tr><td>خلاط المطبخ</td><td>Waring</td><td>7011HB</td><td>زجاج أو وعاء بلاستيكي</td></tr><tr><td>النيتروجين</td> <td>السائل ---</td><td>---</td> <td>المواد الشائعة</td></tr><tr><td>MES&nbsp;</td><td>ROTH</td><td>6066.4</td><td>درجة تحليلية</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERCK</td><td>814733&nbsp;</td><td>درجة تحليلية</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PENTA</td><td>43180-31000</td><td>الصف التحليلي</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>PENTA</td><td>15650-11000</td><td>الصف التحليلي</td></tr><tr><td>Optima XPN100</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>A94469</td> جهاز <td>طرد مركزي فائق</td></tr><tr><td>الفوسفوجليلوز عمود</td><td>VWR</td><td>GENO786-1291</td><td>عمود فارغ</td></tr><tr><td>راتنج الفوسفوجليلوز</td><td>الإبداعي - Biomart ، بما في ذلك</td><td>راتنج التبادل الأيوني</td><td>Phosphate-001C</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>ROTH</td><td>9156.2</td><td>الصف التحليلي</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>PENTA</td><td>24970-31000</td> موازين <td>الدرجة التحليلية</td></tr> <tr><td></td><td>---</td><td>--- </td><td>المعدات المشتركة</td></tr><tr><td>مقص</td> <td>---</td> <td>---</td> <td>المعدات الشائعة</td></tr><tr><td>ملاعق &nbsp ؛</td><td>---</td><td>---</td><td>البلاستيك أو الزجاج</td></tr><tr><td>Ti45 الدوار</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>339160</td><td>الدوار للملاقط فائقة الطرد المركزي</td></tr> <tr><td></td><td>---</td> <td>---</td> <td>المعدات المشتركة</td></tr><tr><td>الترا turrax IKA T18 الأساسية</td><td>IKA</td><td>356 1000</td><td>موزع مختبر</td></tr><tr><td>حمام مائي 37 درجة ؛ C</td><td>---</td><td>---</td> <td>يقلب</td></tr></tbody></table>

تحسين عائد التوبولين من أنسجة المخ الخنازير

Optimizing Tubulin Yield from Porcine Brain Tissue

أثناء خطوات الفصل والتنقية ، تم أخذ عينات من الرحلان الكهربائي SDS-PAGE وتحليلها لاحقا باستخدام تلطيخ Coomassie-blue (الشكل 2). تم خلط 20 ميكرولتر من كل عينة مع 10 ميكرولتر من محلول عينة Laemmli (188 mM Tris-HCl pH 6.8 ، 3٪ SDS (وزن / وزن) ، 30٪ جلسرين (v / v) ، 0.01 بروموفينول أزرق (وزن / وزن) ، 15٪ β-mercaptoethanol) وتم تحضينها عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تم تحميل 4 ميكرولتر من كل عينة على 12.5٪ هلام الأكريلاميد SDS وفصلها تحت تيار ثابت قدره 30 مللي أمبير لكل هلام في ظروف الاختزال وتغيير طبيعة الهواء.
أكدت النتائج زيادة تدريجية في تركيز التوبولين النسبي مصحوبا بانخفاض في البروتينات الملوثة. علاوة على ذلك ، لم يكن هناك فقد كبير في التوبولين في المحللة الموضحة في الطرد المركزي الأول (الخطوة 3.2.7) مقارنة بحذف هذه الخطوة (الشكل 2 أ ، ب).
تم تحديد تركيز البروتين باستخدام ثلاث طرق مستقلة: مقايسة BCA ، ومقايسة بروتين برادفورد ، وتحليل قياس كثافة هلام SDS-PAGE19 (الشكل 3). كان العائد الإجمالي للتوبولين باستخدام الإجراء الموصوف 123 ملغ من توبولين المنقى من 250 غرام من الأنسجة العصبية. أثناء القياسات ، من الضروري مراعاة أن تركيز DTT العالي في مخزن التخزين المؤقت له تأثير كبير على مقايسة BCA. يعمل كل من المخزن المؤقت PEM والمخزن المؤقت PBS ، مع إضافة DTT ، على زيادة امتصاص الخلفية بحوالي 0.900 A595 ، مما يقلل بشكل كبير من قدرة مقايسة BCA (الشكل 3A). يمكن اكتشاف التأثير السلبي ل DTT حتى بعد التخفيف عشر مرات بالماء النقي (البيانات غير معروضة). لا يبدو أن مقايسة برادفورد تتأثر بمخزن التخزين المؤقت (الشكل 3 ب) ، كما أكد تحليل قياس الكثافة.
وتم التحقق من نقاء تحضير التوبولين عن طريق تحليل قياس الطيف الكتلي في مرفقين مستقلين (VRI Brno, الجمهورية التشيكية; CEITEC MU Brno، الجمهورية التشيكية) باستخدام التأين بالرش الكهربائي و MALDI-TOF. أكد كلا التحليلين وجود توبولين الخنازير ألفا وبيتا في العديد من الأشكال المتساوية. كان النقاء الكلي أكثر من 97.07٪ (PSMs 1065) ، مع الشوائب الأكثر انتشارا التي نشأت من نوع الكيراتين من النوع الثاني (PSMs 246 ، 2.24٪ من الشوائب) والتي تم إدخالها على الأرجح أثناء عزل التوبولين وإعداد العينة لتحليل MS / MS. تم تحديد الشوائب الأخرى المكونة من 322 PSMs وفقط ألبومين المصل وجاما الأكتين والتربسينوجين الناشئة عن Sus scrofa بدقة ببتيد واحد (0.0069٪).
في التجارب اللاحقة ، تم التحقق من الحفاظ على قدرة البلمرة بعد التجميد المفاجئ والتخزين في النيتروجين السائل. تمت إزالة القسمة 10 ملغم / مل من النيتروجين السائل وإذابتها ببطء على الجليد. تم تحضير عينات بتركيزات مختلفة (10 ملغم / مل ، 8 ملغم / مل ، 6 ملغم / مل ، 4 ملغم / مل ، و 2 ملغم / مل) عن طريق تخفيف الحصص في المخزن المؤقت PEM الذي يحتوي على DTT و ATP و GTP لتجربة التجميع الذاتي. تم تحضين سلسلة تخفيف واحدة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، وتم تحضين الثانية على الجليد لمدة 60 دقيقة. تم طرد كلتا السلسلتين بالطرد المركزي لمدة 60 دقيقة عند 21000 × جم ودرجة الحرارة المقابلة (4 درجات مئوية أو 37 درجة مئوية). تمت إزالة 30 ميكرولتر من المادة الطافية واستخدامها في SDS-PAGE. تمت إزالة المادة الطافية المتبقية بعناية باستخدام ماصة والتخلص منها. تم غسل الكريات لفترة وجيزة بإضافة 100 ميكرومتر من المخزن المؤقت PEM ، تليها الإزالة الفورية باستخدام ماصة. بعد ذلك ، تم إعادة تعليق الكريات في 50 ميكرولتر من 1x عازلة تحميل SDS مركزة بحيث يتم الحفاظ على التركيز النسبي للحبيبات والمادة الطافية. تمت إضافة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل SDS إلى كل مادة طافية. تم تحليل جميع العينات باستخدام SDS-PAGE و Coomassie Staining (الشكل 4). تم تعديل حجم كل عينة محملة إلى SDS-PAGE وفقا لتركيز البداية ، وبالتالي فإن الفرق في هطول الأمطار بسبب التركيز أكثر وضوحا. أكد اختبار التجميع الذاتي للتوبولين في المخزن المؤقت PEM القدرة على تكوين ألياف توبولين بطريقة تعتمد على درجة الحرارة.
تم إجراء اختبار تجميع توبولين20,21 مدفوع ب MAP2c للتحقق من قدرة التوبولين على التفاعل مع البروتينات الأخرى22. تم تحضير التخفيفات التسلسلية ل MAP2c حيث تم خلط 100 ميكرولتر من 1 ملغم / مل من حصص توبولين مع MAP2c إلى التركيز النهائي الذي يتراوح من 0 ميكرومتر إلى 8 ميكرومتر. تم تحضير جميع العينات على الجليد عن طريق التخفيف في مخزن مؤقت PEM طازج مع 1 mM DTT و 1 mM GTP. تم تحضين التوبولين لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية بتركيزات مختلفة من MAP2c ، وتم طرده مركزيا لمدة 60 دقيقة عند 21000 × جم و 37 درجة مئوية. تم إجراء الغسيل النهائي للحبيبات مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت PEM. أكدت التجربة قدرة التوبولين المحضر على الخضوع للبلمرة المدفوعة ب MAP2c ، حيث أن العينة التي لا تحتوي على MAP2c فقط لم تشكل حبيبات (الشكل 5).
كما تم استخدام المجهر الإلكتروني النافذ لتأكيد وجود خيوط توبولين من تجارب البلمرة المشتركة. تم تحضير معلقات التوبولين المنقى المترسب باستخدام MAP2c للفحص المجهري الإلكتروني النافذ باستخدام التلوين السلبي. تم امتصاص العينات على شبكات نحاسية مطلية بالكربون ومطلية بالفورمات. ثم تم تلطيخ الشبكات بشكل سلبي بنسبة 2٪ NH4MoO4 وفحصها تحت المجهر الإلكتروني عند تكبير 18000x وجهد متسارع يبلغ 80 كيلو فولت. أظهر وجود الأنابيب الدقيقة المتجانسة ذات البنية الخيطية الواضحة والحجم المناسب القدرة على تكوين الأنابيب الدقيقة في التشكل الأصلي (الشكل 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لفصل التوبولين وتنقيته. يشير الرقم الموجود بين قوسين إلى خطوة البروتوكول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig02.jpg"> الشكل 2: فصل التوبولين وتنقيته. (أ) تحليل SDS-PAGE للعينات المأخوذة أثناء فصل التوبولين باستخدام البلمرة المدفوعة بدرجة الحرارة (3 ميكرولتر لكل خط). الانخفاض في الشوائب مع زيادة مستقرة في وفرة التوبولين النسبية (حوالي 50 كيلو دالتون) مرئي. تتوافق الأرقام الموجودة أعلى كل سطر مع رقم الخطوة في البروتوكول. (ب) تحليل SDS-PAGE للكسور التي تم الحصول عليها بعد كروماتوغرافيا البروتين على راتنج الفوسفو السليلوز (4 ميكرولتر لكل خط). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig03.jpg"> الشكل 3: تركيز البروتين. تمت مقارنة سلسلة التخفيف من ألبومين مصل الأبقار حتى 1 مجم / مل في المخزن المؤقت PEM أو PBS مع سلسلة تخفيف BSA التي تحتوي على 0.1 ATP و 1 mM GTP و 1 mM DTT بشكل منفصل أو مجتمعة (0.1 mM ATP و 1 mM GTP و 1 mM DTT) في المخزن المؤقت PEM أو PBS. (أ) عندما تم استخدام اختبار BCA ، كان هناك تحول كبير في خلفية العينات التي تحتوي على DTT (الرموز الصلبة). (ب) لم يتم اكتشاف هذا التأثير عند قياس التركيزات في اختبار برادفورد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig04.jpg"> الشكل 4: مقايسة التجميع الذاتي للتوبولين. أكد تحليل SDS-PAGE لمقايسة التجميع الذاتي قدرة التوبولين المخزن المحتضن إما عند (أ) 4 درجات مئوية أو (ب) 37 درجة مئوية على البلمرة بطريقة تعتمد على درجة الحرارة في مجموعة واسعة من التركيزات. (P - pellet ، S - طافية ؛ يشار إلى تركيز التوبولين المعني فوق كل زوج من الأسطر ؛ كانت كمية كل عينة محملة 10 ميكروغرام). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig05.jpg"> الشكل 5: مقايسة الترسيب المشترك للتوبولين. أكد تحليل SDS-PAGE لتجميع التوبولين بمساعدة MAP2c قدرة التوبولين المخزن على الخضوع للبلمرة مدفوعة بالتفاعل مع البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة بطريقة تعتمد على التركيز. يشار إلى التركيز المولي ل MAP2c فوق كل سطر. (P - بيليه ، S - طاف). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig06.jpg"> الشكل 6: المجهر الإلكتروني النافذ. أظهرت الصور المجهرية TEM أن التوبولين يتجمع (A) في أنابيب دقيقة ذات قطر مناسب (B) تتكون من خيوط توبولين متجانسة مزينة ببروتينات MAP2c. يتوافق الشريط مع 1000 نانومتر (أ) و 200 نانومتر (ب). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Neural tissue from any source is an excellent material for tubulin isolation, as the dendrites and axons of neurons are rich in microtubules. Here, we ...

optimizing-tubulin-yield-from-porcine-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

يوضح الفيديو عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المتسللة إلى الورم من دماغ الفأر باستخدام التفكك الميكانيكي والهضم الأنزيمي. يتبع ذلك الطرد المركزي المتدرج للكثافة لجمع الخلايا المناعية لمزيد من التحليل.

عزل الخلايا المناعية المتسللة للورم من دماغ الفئران

يوضح هذا الفيديو عزل الشعيرات الدموية عن أدمغة الخنازير الطازجة. تتضمن العملية إزالة السحايا ، وعزل المادة الرمادية من أنسجة المخ ، وتجانس المادة الرمادية وتصفيتها لعزل الشعيرات الدموية ، وأخيرا استخدام الهضم الأنزيمي لتنقية الشعيرات الدموية بشكل أكبر.

تنقية الشعيرات الدموية من دماغ الخنازير

يوضح هذا الفيديو عملية عزل الأوعية الدقيقة للدماغ عن الفئران التي تم قتلها رحيم. ويشمل تشريح الدماغ ، وتنظيف الأنسجة ، والهضم الميكانيكي ، يليه الطرد المركزي المتكرر لعزل الجزء النقي من الأوعية الدقيقة.

طريقة لعزل وحدات الأوعية الدموية العصبية عن دماغ الفئران

بينما تم تمييز بنية الريبوسوم على نطاق واسع ، لا يزال تنظيم تعدد الأشكال غير مدروس. للتغلب على هذا النقص في المعرفة ، نقدم هنا بروتوكول تحضير مفصل للتصوير الدقيق لعدسات الثدييات عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) في الهواء والسائل.

يطل في الدماغ Polysomes مع مجهر القوة الذرية

وهدف البروتوكول تقديم إجراء محسنة لإنشاء في المختبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) نموذجا يستند إلى خلايا المخ الخنزيري الابتدائي غشائي (ببيكس). نموذج يظهر إمكانية تكرار نتائج عالية، ضيق عالية، وهي مناسبة للدراسات المتعلقة بالنقل والاتجار داخل الخلايا في اكتشاف الأدوية.

تحسين أسلوب لإنشاء في المختبر حاجز الدم – المخ نموذج استناداً إلى خلايا المخ الخنزيري بطانية

تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد قدر ة نشاط نظام يوبيكويتين بروتياسوم (UPS) بكفاءة في مقصورات خلوية مختلفة من الدماغ القوارض. ويتمكن المستخدمون من فحص أداء شركة UPS في الكسور النووية والسيتوبلازمية ومتشابكة في نفس الحيوان، مما يقلل من مقدار الوقت وعدد الحيوانات اللازمة لإجراء هذه التحليلات المعقدة.

قياس النشاط شبه الخلوي يوبيكويتين بروتياسوم في الدماغ القوارض

نحن نقدم بروتوكول لاستخراج العجانات الدماغية murine. استنادا إلى التخصيب الخالي من المضادات الحيوية استخراج perسيلات المنحى ، وهذا البروتوكول هو أداه قيمه للدراسات في المختبر توفير عاليه النقاء والغلة العالية ، التالي خفض عدد الحيوانية التجريبية المستخدمة.

طريقه إخراج عاليه لعزل Pericytes الدماغي من الماوس

يصف هذا البروتوكول تنقية التوبولين من مصادر صغيرة / متوسطة الحجم مثل الخلايا المستزرعة أو أدمغة الماوس الواحدة ، وذلك باستخدام دورات البلمرة وإزالة البوليمر. يتم إثراء التوبولين المنقى في أنواع متساوية محددة أو لديه تعديلات محددة بعد النقل ويمكن استخدامه في فحوصات إعادة تشكيل المختبر لدراسة ديناميكيات microtubule والتفاعلات.

تنقية توبولين مع التعديلات ما بعد النقل الخاضعة للرقابة وIsotypes من مصادر محدودة من قبل دورات البلمرة- Depolymerization

نحن نبلغ عن فحص بسيط وفعال للوقت وعالي الإنتاجية يستند إلى التحليل الطيفي للتحديد الكمي لخيوط أكتين في عينات بيولوجية من أنسجة الدماغ للقوارض والموضوعات البشرية.

مطياف مفلور فعال من حيث الوقت لتقييم حالة البلمرة في القوارض وأنسجة الدماغ البشرية

تلعب الأنابيب الدقيقة ، وهي بوليمرات توبولين ، دورا مهما كمكون للهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة ومعروفة بعدم استقرارها الديناميكي. طورت هذه الدراسة طريقة لتجزئة الأنابيب الدقيقة لفصلها إلى أنابيب دقيقة مستقرة ، وأنابيب دقيقة قابلة للتعديل ، وتوبولين حر لتقييم استقرار الأنابيب الدقيقة في أنسجة الفئران المختلفة.

تقنية تجزئة الأنابيب الدقيقة الكمية لفصل الأنابيب الدقيقة المستقرة والأنابيب الدقيقة المرنة والتوبولين الحر في أنسجة الفئران

أبلغنا عن تقنية تسمح بالتصوير الحي لديناميكيات الأنابيب الدقيقة في خلايا الورم الأرومي الدبقي (GBM) التي تغزو أنسجة المخ الفقارية. يسمح اقتران الحقن التقويمي لخلايا GBM الموسومة بالفلورسنت في دماغ الزرد الشفاف مع التصوير الداخلي عالي الدقة بقياس ديناميكيات الهيكل الخلوي أثناء غزو السرطان في الموقع .

التصوير الحي لديناميات الأنابيب الدقيقة في خلايا الورم الأرومي الدبقي التي تغزو دماغ الزرد

تعلم عزل التوبولين بعائد عالٍ من أنسجة مخ الخنازير باستخدام الطرد المركزي والتجانس. تُحافظ هذه الطريقة على ديناميكيات البروتين الطبيعية لدراسة التفاعلات الخلوية وتصميم الأدوية.

تحسين عائد التوبولين من أنسجة المخ الخنازير

استكشف المزيد من الفيديوهات