بروتوكول لتقييم وقياس أمراض ظهارة الشبكية المصطبغة في نماذج الفئران من التنكس البقعي المرتبط بالعمر
March 10th, 2023
يمكن أن تكون نماذج الماوس أدوات مفيدة للتحقيق في بيولوجيا ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE). لقد ثبت أن الفئران يمكن أن تطور مجموعة من أمراض RPE. هنا ، نصف بروتوكول التنميط الظاهري لتوضيح وقياس أمراض RPE في الفئران باستخدام الضوء وإلكترون الانتقال والمجهر متحد البؤر.
هذا البروتوكول هو الأول الذي يصف كيفية معالجة وتقييم حجم الماوس لأمراض RP باستخدام إلكترون انتقال الضوء والمجهر متحد البؤر. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي إدراج التقييمات الكمية لأمراض RP ، باستخدام تقنيات التصوير الثلاثة هذه للمقارنات الإحصائية. قد تساعد التقنيات الموضحة في هذا البروتوكول أيضا في توسيع معرفتنا بالمسارات الجزيئية المهمة لصحة RPE.
قد يعاني الأفراد الذين لم يسبق لهم تشريح حجم الماوس مع هذا البروتوكول. نقترح أن يتدرب هؤلاء الأفراد مع بعض الفئران لإتقان التقنيات الموضحة في هذا البروتوكول. للبدء ، قم بإعداد نظام تروية تغذية الجاذبية على وسادة سفلية ماصة للتروية القلبية في غطاء الدخان.
صب 40 ملليلتر من العازلة المثبتة الطازجة في برميل حقنة لنظام التروية. أدر الصمام موازيا لخط الأنبوب للسماح للمخزن المؤقت بالتدفق عبر خط الأنبوب. اغسل الخط حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء من الخط.
ثم أدر الصمام عموديا على خط الأنبوب لمنع المخزن المؤقت من التدفق إلى خط الأنبوب. لإجراء التروية القلبية ، انقل الماوس الرحيم إلى صينية ضحلة بالقرب من نظام التروية. مع توجيه البطن لأعلى.
رش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم قم بإنشاء قطع أدنى بمقدار خمسة سنتيمترات باستخدام مقص وملقط منحني عبر الجلد وجدار البطن على الجانب الأيسر من الماوس أسفل القفص الصدري. المضي قدما في جعل قطع الإنسي ثلاثة سنتيمترات من خلال الجلد وجدار البطن في الجزء العلوي من قطع أدنى. قم بعمل قطع آخر أقل شأنا بمقدار خمسة سنتيمترات في نهاية القطع الإنسي عبر الجلد وجدار البطن على الجانب الأيمن الأبعد من الماوس أسفل القفص الصدري.
قم بعمل شق وسطي آخر بطول ثلاثة سنتيمترات لإزالة رفرف جلد البطن بالملقط المنحني. بعد ذلك ، قم بقطع الحجاب الحاجز والقص لفضح القلب. أدخل إبرة القياس في البطين الأيسر للقلب وأدر الصمام.
اقطع الأذين الأيمن بمقص منحني للسماح للدم والمثبت بالخروج من القلب. اترك 10 ملليلتر من المخزن المؤقت المثبت لتخلل الفأر لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، أو حتى يصبح لون الكبد شاحبا ولا يتدفق الدم من الأذين الأيمن. بمجرد اكتمال التروية ، أدر الصمام عموديا على خط الأنبوب لإيقاف تدفق المخزن المؤقت.
لنواة العينين ، قم بإزالة الماوس من الدرج الضحل وضعه على الوسادة السفلية الماصة في غطاء الدخان. ثم قم بتوجيه رأس الماوس بحيث تواجه العين اليسرى المجرب والعين اليمنى بعيدا عن الأنظار. قم بالتعليق على الجانب العلوي من العين باستخدام صبغة وسم الأنسجة.
ادفع برفق لأسفل حول محجر العين بالإبهام والسبابة لبروز العين من محجر العين. ثم باستخدام مقص منحني ، أمسك العين بالشفرة بزاوية 30 درجة من مقبس العين واقطعها حول العين. أخرج مقلة العين من الرأس بالملقط المنحني وضعها على وسادة سفلية ماصة.
قم بشق القرنية بشفرة مشرط رقم 11 وضع العين بملقط منحني في أنبوب دقيق سعة 2 ملليلتر يحتوي على ملليلتر من المخزن المؤقت المثبت. بعد نواة كلتا العينين ، احتضنهما في مخزن مؤقت مثبت طوال الليل على شاكر في غرفة أربع درجات بسرعة 75 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، استبدل المخزن المؤقت المثبت بملليلتر من PBS واحتضانه لمدة 10 دقائق على شاكر في درجة حرارة الغرفة و 75 دورة في الدقيقة.
بجانب توليد شرائح خلفية ، ضع العين في طبق بتري مملوء ب PBS تحت مجهر تشريح. ارفع أي دهون وعضلات برفق بعيدا عن مقلة العين باستخدام ملقط رفيع. تقليم الدهون والعضلات بعناية باستخدام مقص تشريح دقيق في اتجاه مواز لمقلة العين حتى يكون لمقلة العين لون أسود مزرق موحد ضع ملقط رفيع في موقع ثقب القرنية واقطع حول محيط القرنية بدءا من موقع البزل بمقص تشريح دقيق لإزالة القرنية والقزحية من مقلة العين.
ثم باستخدام ملقط رفيع ، قم بإزالة العدسة برفق من مقلة العين للحصول على الجزء الخلفي. ضع الجزء الخلفي في أنبوب يحتوي على ملليلتر PBS ، واحفظه في أربع درجات مئوية في الثلاجة حتى الاستخدام. نقل العين إلى طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني وإزالة القرنية والقزحية كما هو موضح.
اسحب العدسة بملقط رفيع. ثم باستخدام ملقطين رفيعين ، افصل الشبكية العصبية برفق عن الجزء الخلفي. قطع بعناية شبكية العين العصبية في رأس العصب البصري لإزالتها من كأس العين الخلفية.
ضع كوب العين في أنبوب صغير سعة 2 ملليلتر يحتوي على خمسة ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. لإصلاح أكواب العين الخلفية ، أضف 500 ميكرولتر من الميثانول إلى الأنسجة واحتضانها على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة ، لمدة خمس دقائق. كرر تثبيت الميثانول ثلاث مرات مع الحضانة النهائية لمدة ساعتين.
بعد التثبيت ، اغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، قبل الشروع في تلطيخ التألق المناعي والتصور من خلال الفحص المجهري متحد البؤر. أظهرت فئران TMEM 135 TG البالغة من العمر أربعة أشهر انخفاضا كبيرا في ظهارة الشبكية المصطبغة أو سمك RPE عند 600 و 900 ميكرومتر بعيدا عن العصب البصري ، مقارنة بالفئران البرية المطابقة للعمر. تم حساب حوادث أمراض RPE بما في ذلك الأوعية الدقيقة ، والفراغ الكبير وهجرة الفئران WT و TMEM 135 TG البالغة من العمر 325 يوما.
كان متوسط تواتر الفراغ الدقيق RPE أقل في النوع البري مقارنة بفئران TMEM 135 TG. لم يتم الكشف عن أي فراغ كرو RPE وهجرة في النوع البري مقارنة بمتوسط القيم التي لوحظت في الفئران TMEM 135 TG. في المجهر الإلكتروني النافذ ، لوحظت رواسب رقائقية قاعدية في شبكية العين البالغة من العمر 24 شهرا والتي كانت غائبة في شبكية العين البالغة من العمر شهرين.
أشار تحليل الترددات التراكمية لارتفاعات الرواسب الصفحية القاعدية إلى تحول إلى يمين الخط لعمر 24 شهرا ، مقارنة بعمر شهرين ، مما يدل على زيادة في الرواسب في الفئران البالغة من العمر 24 شهرا. تم دعم هذه الملاحظة من خلال متوسط ارتفاعات أكبر في شبكية العين البالغة من العمر 24 شهرا. كان RPE في الفئران TMEM 135 TG البالغة من العمر أربعة أشهر مشوها.
RPE في شبكية العين TMEM 135 TG أكبر وأقل كثافة من شبكية العين من النوع البري المطابق للعمر. أيضا ، لوحظ المزيد من خلايا RPE متعددة النوى في شبكية TG ، مقارنة بالضوابط. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين تقييم مسارات محددة باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية في الفئران ، مما قد يساهم في فهمنا لكيفية تطور أمراض RP هذه في الفئران.
سيساعد هذا البروتوكول على توحيد التنميط الظاهري RP في الفئران ، والذي سيترجم نتائج دراسات الفئران إلى نماذج AMD الأخرى ويساعد في فهمنا لعلم الأحياء المرضي AMD.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
المراجعة
يصف هذا البروتوكول طريقة لمعالجة وتقييم نماذج الفئران للتحقيق في أمراض الظهارة الصبغية الشبكية (RPE). باستخدام الميكروسكوب الضوئي، والميكروسكوب الإلكتروني العادي، والميكروسكوب المجسم، يتيح هذا النهج تقييمات كمية لصحة RPE.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الشبكية
- علم الأمراض
الخلفية
- نماذج الفئران قيمة لدراسة بيولوجيا RPE.
- يمكن للفئران تطوير أمراض RPE مختلفة.
- فهم هذه الأمراض أمر بالغ الأهمية للتقدم في أبحاث صحة الشبكية.
- يهدف هذا البروتوكول إلى تعزيز تقييم حالات RPE.
غرض الدراسة
- وصف بروتوكول النمط الظاهري لأمراض RPE في الفئران.
- توفير تقييمات كمية باستخدام تقنيات التصوير المتقدمة.
- تسهيل المقارنات الإحصائية لصحة RPE.
الطرق المستخدمة
- الميكروسكوب الضوئي للتقييمات الأولية.
- الميكروسكوب الإلكتروني العادي لتحليل هيكلي مفصل.
- الميكروسكوب المجسم لتصوير عالي الدقة.
- تحضير التروية القلبية لمعالجة الأنسجة.
النتائج الرئيسية
- التنفيذ الناجح لبروتوكول النمط الظاهري الشامل.
- بيانات كمية عن أمراض RPE تم الحصول عليها من تقنيات التصوير.
- فهم محسن للمسارات الجزيئية المتعلقة بصحة RPE.
- يساعد البروتوكول في إتقان تقنيات التشريح للباحثين.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول إطارًا قويًا لدراسة أمراض RPE.
- تقنيات التصوير الكمية ضرورية للتقييمات الدقيقة.
- يمكن للبحوث الإضافية أن تبني على هذه النتائج لتحسين صحة الشبكية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Standardized, quantitative phenotyping of retinal pigmented epithelium (RPE) pathologies in mouse models is critical for de-risking early discovery in age-related macular degeneration (AMD) research. This protocol enables reproducible, unbiased assessment of RPE dysfunction, supporting predictive confidence in target validation and translational continuity across preclinical AMD models. Enterprise R&D teams benefit from robust statistical outputs that inform portfolio triage and mechanistic prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of RPE dysfunction as a mechanistic driver in AMD models.
- Supports functional target validation by quantifying pathologies linked to disease progression.
- Facilitates predictive confidence in pathway selection and early portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated mouse RPE systems for downstream compound screening workflows.
- Standardizes quantitative imaging outputs for reproducibility and cross-study comparability.
- Enables reliable evaluation of candidate interventions targeting RPE health.
Translational & Preclinical Research
- Aligns murine RPE pathology readouts with human AMD features for translational relevance.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling unbiased statistical comparisons.
- De-risks advancement decisions by providing robust, quantitative endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational model validation in AMD research.
- Discovery Biology: Quantitative imaging and statistical testing clarify RPE dysfunction mechanisms and pathway involvement.
- Screening: Standardized phenotyping ensures assay readiness and reproducibility for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of RPE thickness, vacuolization, and deposit formation for condition comparison.
- Translational Research: Provides endpoints that align with human AMD pathology for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across AMD mouse models, supporting platform-wide standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in AMD target validation.
- Operational Value: Delivers reproducible, scalable, and unbiased quantitative assessments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of AMD therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and advanced microscopy techniques.
- Demands access to light, transmission electron, and confocal microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification protocols.
- Adaptable to various mouse models of AMD with protocol-specific optimizations.
- Practical limitations include technical learning curve and need for statistical rigor in data analysis.
