مايو 2, 2025
يصف هذا البروتوكول توليد العضيات الكبدية الباطنة السريعة والقابلة للتكرار (eHEPOs). باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن إنتاج eHEPOs في غضون أسبوعين والتوسع على المدى الطويل (أكثر من عام) دون أن تفقد تمايزها ووظائفها.
يهدف بحثنا إلى تطوير نماذج الكبد في المختبر ذات الصلة بالإنسان لاختبار فعالية الأدوية وسلامتها ، ومحاكاة أنسجة الكبد السليمة والمريضة عن كثب في الدراسات قبل السريرية. لا يزال إعادة إنتاج تعقيد الكبد الكامل ، وتحقيق وظائف طويلة الأجل ، وتوحيد البروتوكولات ، وتوسيع نطاق إنتاج المواد العضوية للتطبيقات عالية الإنتاجية تحديا تجريبيا رئيسيا في أبحاث الأعضيات. قمنا مؤخرا بنمذجة تليف الكبد من العضيات الكبدية السليمة وأنشأنا نماذج أمراض نادرة في الكبد ، بما في ذلك نقص السيترولينميا وكربوكسيلاز البيروفات ، من الخلايا المشتقة من المريض. على عكس الطرق الأخرى ، يوفر بروتوكول eHEPO الخاص بنا عضيات الكبد الوظيفية بسرعة وعلى نطاق واسع ، مما يدعم الوظائف طويلة الأجل والمقايسات المتعددة من مجموعة واحدة متسقة.
[راوي] للبدء ، أضف 6 ملليلتر من DMEM / F-12 البارد في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أضف على الفور 80 ميكرولتر من مصفوفة غشاء القاعدة FOD أو BMM إلى الأنبوب واخلطها جيدا. قم بتغطية صفيحة البئر المعالجة بزراعة الأنسجة بمحلول BMM ووزع المحلول لتغطية سطح لوحة البئر. احتضن الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل. خذ خلية جذعية محفزة متعددة القدرات أو لوحة IPSC واستنشق الوسط الخاص ب IPSC. اشطف اللوحة باستخدام DMEM / F-12 أو DPBS وأضف 1 مل من الإنزيم المحدد إلى بئر واحد من صفيحة ذات 6 آبار. بعد الحضانة لمدة دقيقة واحدة ، استنشق الإنزيم واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى سبع دقائق. بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من وسط IPSC المسخن مسبقا إلى اللوحة واضغط برفق على الجانب لفصل مجاميع المستعمرات غير المتمايزة عن سطح اللوحة. امزج المعلق برفق مع ماصة مصلية سعة 5 ملليلتر ، ثم قم بزرع تعليق الخلية بالكثافة المطلوبة على البئر المطلي ب BMM. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام للوصول إلى التقاء 70٪. استبدل وسيط IPSC بوسيط الأديم الباطن قبل بدء التمايز. تكتسب الخلايا شكلا شائكا بعد التمايز ، مما يشير إلى تفاعل الخلية والخلية. شطف خلايا الأديم الباطن مع PBS. أضف 300 ميكرولتر من التربسين. واحتضان الخلايا لمدة خمس دقائق في الحاضنة. أضف 3 ملليلتر من DMEM/F-12 البارد إلى الخلايا والماصة باستخدام أطراف مرشح سعة 1,000 ميكرولتر لتوليد خلايا مفردة. اجمع معلق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلترا وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الطافية ، اغسل الحبيبات ب 10 ملليلتر من مخزن FACS. لعمل تعليق أحادي الخلية ، قم بتصفية الخلايا بمصفاة شبكية 100 ميكرومتر ثم باستخدام مصفاة شبكية 40 ميكرومتر قبل طرد تعليق الخلية لمدة خمس دقائق. أعد تعليق 15 مليون خلية مع 105 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وأضف 45 ميكرولتر من FcR و 15 ميكرولتر من EpCAM إلى المعلق. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وحماية الأنبوب من الضوء. ثم أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لغسل تعليق الخلية. بعد طرد الخلايا بالطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من مخزن FACS المؤقت وأضف 0.5 ميكرومولار لكل مليلتر DAPI إلى تعليق الخلية لتحديد الخلايا الميتة. بعد فرز الخلية ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية. وأعد تعليق 3,000 إلى 5,000 خلية في 20 ميكرولتر من BMM. قم بزرع الخلايا عن طريق إضافة قطرة من BMM إلى وسط كل صفيحة مكونة من 48 بئرا ، واحتضان الخلايا لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية حتى يتم ترسيخ BMM. تراكب القطرة مع وسط التمدد. لتقسيم القطرة العضوية ، تخلص من الوسط العضوي وأضف 500 ميكرولتر من Ad-DMEM / F-12 البارد إلى البئر. استخدم أطراف مرشح سعة 1,000 ميكرولتر لماصة قطرات BMM بقوة. اجمع 10 قطرات BMM كحد أقصى في أنابيب مخروطية سعة 15 مليلترا وأضف 5 ملليلتر من Ad-DMEM / F-12 البارد. ضع الأنبوب على الثلج لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية حتى يبقى 1 ملليلتر من المادة الطافية. قم بماصة حبيبات الخلية بقوة من 30 إلى 40 مرة باستخدام أطراف مرشح 200 ميكرولتر. بعد التفكك الميكانيكي ، أضف 5 ملليلتر من Ad-DMEM / F-12 البارد قبل طرد الخلايا لمدة خمس دقائق. تخلص من الطواقي. ووضع التعليق على الجليد. زرع قطرة BMM 50 ميكرولتر. وأضف 25 نانوغراما لكل مليلتر BMP7 إلى وسط التمدد. بعد الزراعة لمدة ثلاثة أيام ، استبدل الوسط بوسط التمايز وزرع الخلايا لمدة 14 يوما على الأقل. تم إجراء تحليل تلطيخ مناعي للتحقق مما إذا كانت العضيات التي تنشأ من خلايا EpCAM + ملتزمة بالسلالة الكبدية. يشير وجود خلايا CK19 + و HNF4ɑ + إلى وجود خلايا سلف الأرومة الكبدية والقناة الصفراوية في الأعضيات. بالإضافة إلى ذلك ، تشير العضيات التي تعبر عن علامات الأنسجة الظهارية ، مثل خلايا E-CAD + والخلايا الظهارية التكعيبية أو متعددة السطوح التي تعبر عن ZO-1 ، إلى وجود وصلات ضيقة بين الخلايا. كشفت الكيمياء المناعية أن خلايا E-CAD + أظهرت بنية ظهارية متعددة الأضلاع ، مما يعكس نمطا ظاهريا يشبه خلايا الكبد. يتم عرض صور الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ل eHEPOs هنا. تشير الدوائر البيضاء إلى المجمعات الوصلية بين الخلايا. تظهر الأسهم السوداء تمايز السطح القمي. ويظهر السهم الأحمر قسما عرضيا من الزغابات الدقيقة. أظهر تحليل qPCR أن العضيات اكتسبت علامات خلايا الكبد الناضجة مثل ALB و A1AT و CYP3A4 و CYP3A7. تشير المنطقة الملطخة باللون الوردي في تلطيخ PAS إلى سعة تخزين الجليكوجين للعضويات. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليلنا قدرة الأعضيات على إفراز ALB في وسائط الاستزراع ، والقضاء على الأمونيا من وسائط الاستزراع ، ونشاط إنزيم CYP3A4 ، وقدرة نقل الأحماض الصفراوية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
يصف هذا البروتوكول طريقة توليد عضوانيات كبدية داخلية سريعة وقابلة للتكرار (eHEPOs). ومن خلال هذا البروتوكول، يمكن إنتاج eHEPOs في غضون أسبوعين وتوسيعها على المدى الطويل (أكثر من عام واحد) دون فقدان تمايزها ووظائفها.
يُتيح التوليد السريع والقابل للتكرار للعضوانيات الكبدية الوظيفية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات إمكانية نمذجة الأمراض وتقييم الأدوية في المرحلة قبل السريرية بشكل قوي. وتلبي هذه القدرة الحاجة إلى أنظمة كبدية قابلة للتطوير وذات صلة فسيولوجية تحافظ على التمايز والوظيفة عبر فترات زراعة ممتدة. ويدعم هذا النهج الاستمرارية الانتقالية ويقلل من مخاطر قرارات المحفظة الدوائية في المراحل المبكرة من خلال توفير مصدر متجدد من أنسجة شبيهة بالخلايا الكبدية البشرية.
يضع هذا البروتوكول عملية توليد العضوانيات الكبدية عند نقطة التقاء الاكتشافات الأولية، وتحديد المركبات الواعدة، والأبحاث قبل السريرية، مما يدعم الاختبار التكراري للفرضيات وفرز المركبات.