ATAC-Seq الخاص بالخلايا الشحمية مع الأنسجة الدهنية باستخدام فرز النواة المنشطة بالفلورة
مارس 17, 2023
نقدم بروتوكولا لفحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) على وجه التحديد على الخلايا الشحمية باستخدام فرز النواة مع الأنسجة الدهنية المعزولة من الفئران المراسلة المعدلة وراثيا مع وضع العلامات الفلورية النووية.
ATAC-seq هي تقنية قوية لفهم آليات تنظيم التعبير الجيني. ومع ذلك ، يصعب استخدام الأنسجة الدهنية باستخدام هذه التقنية بسبب محتوياتها الدهنية الكبيرة ، وتلوث الميتوكوندريا العالي ، وعدم التجانس الخلوي. في هذا البروتوكول ، تم إجراء تسلسل ATAC الخاص بالخلايا الشحمية باستخدام فرز النواة المنشط بالفلورة ، والذي يولد بيانات عالية الجودة مع الحد الأدنى من تلوث الحمض النووي للميتوكوندريا.
يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة في الأنسجة الأخرى حيث تتوفر خطوط فأر Cre الخاصة بنوع الخلية مع خطوط مراسل معدلة وراثيا لوضع العلامات النووية. ابدأ عزل النواة عن طريق تبريد الزجاج Dounce المجانسات على الجليد بكوب واحد Dounce لكل عينة. ثم أضف 7 ملليلتر من مزيج NPB إلى كل كوب ترتد.
ثم ضع 50 إلى 100 ملليغرام من الأنسجة الدهنية المجمدة في كوب Dounce ، وقم بتقطيعها إلى بضع قطع أصغر باستخدام مقص طويل. السكتة الدماغية 10 مرات مع مدقة فضفاضة لجميع العينات ، ثم 10 مرات مع مدقة ضيقة. قم بتصفية المحتوى من خلال مصفاة 100 ميكرومتر إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر قبل نقل التجانسات المفلترة إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر للطرد المركزي.
بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS-N عن طريق النقر بالأصابع بلطف ولكن شامل. بعد ذلك ، قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 ملليلتر وشطف المصفاة ب 250 ميكرولتر من PBS-N. انقل المعلق النووي المرشح إلى فرز الخلايا المنشطة بالفلورة أو أنبوب FACS باستخدام ماصة ميكروية.
قم بإعداد أنبوب التجميع بإضافة 500 ميكرولتر من PBS-N إلى الأنبوب الجديد سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بقلبه عدة مرات لتبليل جميع الأسطح الداخلية بالمخزن المؤقت. قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة لإسقاط كل السائل قبل وضعها على الجليد حتى الفرز. بالنسبة ل FACS ، استخدم بوابة FSC-A / FSC-H للمفردات الفردية و FSC-A / SSC-A لإزالة الحطام الصغير أو الكبير.
بوابة لسكان نواة الخلايا الشحمية الإيجابية mCherry / GFP ، وجمع 10،000 نواة في كل أنبوب تجميع تم إعداده مسبقا. لإعداد نواة ما بعد الفرز ، أضف 500 ميكرولتر من PBS-N إلى كل أنبوب تجميع واخلطه عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات قبل الطرد المركزي لأنابيب التجميع عند 200 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تماما إزالة طاف.
لتحضير 25 ميكرولترا من الخليط الرئيسي Tn5 ، امزج 12.5 ميكرولترا من محلول الحمض النووي 2x أو المخزن المؤقت TD ، و 1.25 ميكرولتر من Tn5 transposase أو إنزيم TDE I ، و 11.25 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من خليط Tn5 الرئيسي إلى كل حبة نواة وأعد تعليقها عن طريق السحب اللطيف. احتضان عند 600 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام خلاط حراري.
أضف 25 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز إلى 25 ميكرولترا من خليط إعادة تعليق نواة Tn5 مما يجعل الحجم النهائي 50 ميكرولتر. ثم أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت PB و 5 ميكرولتر من 3 M أسيتات الصوديوم مع الرقم الهيدروجيني 5.2. بعد نقل الخليط إلى عمود مزود بالمجموعة المشار إليها ، قم بطرده عند 17،900 جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد التخلص من التدفق ، ضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع. أضف 750 ميكرولترا من المخزن المؤقت PE الذي يحتوي على الإيثانول المطلق إلى الأنبوب. قم بطرد العمود ، وتجاهل التدفق ، ثم ضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع.
جهاز طرد مركزي الأنبوب ، وتجاهل أنبوب التجميع مع التدفق. لتضخيم شظايا الحمض النووي المنقولة ، قم بإعداد الخليط الرئيسي PCR دون إضافة Ad2 فريد. n التمهيدي الترميز الشريطي.
قم بتشغيل PCR. قم بتشغيل PCR الكمي أو qPCR. تحقق من منحنيات التضخيم وحدد عدد دورات PCR الإضافية المطلوبة من خلال تقدير عدد الدورات التي وصلت إلى ما يقرب من 35٪ من الحد الأقصى.
استخدم الحسابات لتشغيل PCR لل 45 ميكرولتر المتبقية من تفاعل PCR. باستخدام الإجراءات السابقة ، قم بإزالة شظايا الحمض النووي المضخمة ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB. انقل الحمض النووي المستخلص إلى أنبوب PCR جديد واضبط الحجم على 100 ميكرولتر بإضافة 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB. بعد ذلك ، أضف 55 ميكرولترا من حبات SPRI واخلطها عن طريق الماصة. بعد 5 دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، افصلها على حامل مغناطيسي صغير لمدة 5 دقائق.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقل 150 ميكرولترا من المادة الطافية إلى أنبوب PCR جديد ، وأضف 95 ميكرولترا من حبات SPRI ، واخلطها عن طريق الماصة. احتضان التفاعل لمدة 5 دقائق قبل فصل الخرز على الحامل المغناطيسي الصغير. تخلص من المادة الطافية بعناية واغسل الخرز لمدة 1 دقيقة باستخدام 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪.
كرر غسلتين أخريين. بعد الغسيل النهائي ، أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 1000 غرام لمدة 1 دقيقة. ماصة من الإيثانول المتبقية وتجفيف بيليه في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة على جهاز PCR مع غطاء مفتوح.
بمجرد التجفيف ، أعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت EB عن طريق سحب الأنبوب واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. افصل الخرزات لمدة 5 دقائق على الحامل المغناطيسي الصغير قبل نقل 18 ميكرولترا من المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة النهائية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. كانت نوى الخلايا الشحمية الموسومة بالكرز mCherry والموسومة ب GFP مميزة عن نوى أنواع الخلايا الأخرى المعزولة عن الأنسجة الدهنية لفأر Adipoq-NuTRAP.
اعتمادا على نوع المستودع الدهني ، يكون الفرق حوالي 50٪ في eWAT ، و 30٪ في iWAT ، و 65٪ في BAT في كسور الخلايا الشحمية. أشارت العينات التي تتطلب أكثر من 15 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى عينات منخفضة الجودة. أظهر تحليل توزيع الحجم لمكتبات ATAC-seq قمم متعددة تتوافق مع المنطقة الخالية من النيوكليوسومات ، أو NFR ، والنيوكليوسومات الأحادية والثنائية والمتعددة بمتوسط أحجام يتراوح بين 500 و 800 زوج أساسي تقريبا.
أظهرت العينات ذات الجودة الرديئة عادة في الغالب NFR مع عدم وجود قمم نووية أو عدد قليل منها. أظهرت اختبارات فحص الجودة التي أجراها تحليل qRT-PCR إثراء من 10 إلى 20 ضعفا بالعناصر الجينومية الإيجابية بالقرب من جينات علامات الخلايا الشحمية مثل Adipoq و Fabp4 و Plin1 و Pnpla2 ، بينما لم يظهر أي إثراء مع التحكم السلبي. لوحظ التخصيب بالجين الحراري Ucp1 على وجه التحديد في BAT.
كانت قراءات الميتوكوندريا أقل من 2٪ وكان الكسر تحت القمم حوالي 18٪ إلى 44٪ تم الكشف عن قمم قوية متعددة ذات نسب إشارة إلى ضوضاء عالية بالقرب من جينات علامات الخلايا الدهنية مثل Adipoq و Fabp4 و Plin1 من جميع المستودعات الدهنية. لوحظت قمم ATAC-seq قوية في موضع علامة الخلايا الدهنية البنية Ucp1 في عينة BAT. العامل الأكثر أهمية لهذا البروتوكول هو جودة النواة.
من المهم استخدام عينات أنسجة عالية الجودة والتعامل مع النوى برفق طوال التجربة ، خاصة أثناء إعادة التعليق بعد الطرد المركزي والفرز. من المهم أن نتذكر أن هذا البروتوكول يعتمد على الفئران المراسل المعدلة وراثيا مع وضع العلامات النووية. تم استخدام الفئران NuTRAP هنا ، ولكن يمكن استخدام أي نظام مماثل.
باستخدام بيانات FACS الخاصة بنا ، يمكن للمرء إجراء تحليل حسابي متعدد للعثور على عوامل النسخ الرئيسية التي تنظم التعبير الجيني في البيئات البيولوجية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لإجراء ATAC-seq بشكل خاص على الخلايا الدهنية باستخدام فرز النوى. تستخدم الطريقة أنسجة دهنية معزولة من الفئران المبلغة المعدلة وراثيًا مع علامات فلورة نووية لتوليد بيانات عالية الجودة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الجينوم
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- ATAC-seq هي تقنية تُستخدم لدراسة آليات تنظيم التعبير الجيني.
- تشكل الأنسجة الدهنية تحديات لـ ATAC-seq بسبب محتوى الدهون والتغاير الخلوي.
- يساعد فرز النوى المنشط بالفلورة على تقليل تلوث الحمض النووي للميتوكوندريا.
- يمكن تعديل هذه الطريقة لمناسبتها أنسجة أخرى باستخدام خطوط فئران Cre محددة.
غرض الدراسة
- تطوير بروتوكول ATAC-seq موثوق به للخلايا الدهنية.
- تحسين جودة البيانات عن طريق تقليل التلوث.
- توفير طريقة قابلة للتطبيق على أنواع مختلفة من الأنسجة.
الطرق المستخدمة
- عزلة الأنسجة الدهنية من الفئران المبلغة المعدلة وراثيًا.
- تبريد مجانزات Dounce الزجاجية على الثلج لتحضير العينات.
- استخدام مزيج NPB محدد لعزل النوى.
- فرز النوى المنشط بالفلورة للحصول على نوى عالية الجودة.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للنوى من الخلايا الدهنية مع تلوث أدنى.
- بيانات ATAC-seq عالية الجودة تم إنشاؤها من الأنسجة الدهنية.
- البروتوكول قابل للتكيف مع أنواع خلايا أخرى ذات تسمية نووية.
- الفعالية المثبتة للطريقة في دراسة تنظيم الجينات في الخلايا الدهنية.
الاستنتاجات
- يسمح البروتوكول المطور بـ ATAC-seq فعال في الخلايا الدهنية.
- تقليل التلوث بالميتوكوندريا أمر حاسم لسلامة البيانات.
- يمكن تمديد هذه الطريقة لتشمل أنسجة أخرى، مما يعزز فائدتها في البحث.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific ATAC-seq in adipose tissue addresses a critical bottleneck in chromatin accessibility profiling for metabolic disease research and target validation. By enabling high-fidelity isolation of adipocyte nuclei, this protocol reduces confounding signals from cellular heterogeneity and mitochondrial contamination, supporting more predictive and actionable genomic insights. The approach enhances confidence in regulatory element mapping, directly impacting early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of chromatin accessibility in adipocytes, clarifying regulatory mechanisms underlying metabolic pathways.
- Reduces biological ambiguity by isolating pure adipocyte nuclei, supporting robust functional target validation.
- Improves predictive confidence in linking regulatory elements to gene expression changes relevant to disease models.
Screening & Assay Development
- Provides validated, cell-type-specific chromatin profiles for downstream assay development and screening workflows.
- Facilitates reproducible and quantitative assessment of chromatin states, supporting assay standardization.
- Minimizes wasted sequencing reads and reagent use, increasing operational efficiency for high-throughput studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin accessibility data with disease-relevant adipocyte biomarkers, supporting translational biomarker discovery.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by providing high-quality, cell-type-resolved epigenomic data.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying mechanistic links between chromatin state and gene regulation in metabolic tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling cell-type-specific chromatin profiling in adipose tissues, supporting both early target validation and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating regulatory elements active in adipocytes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative chromatin accessibility data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides high signal-to-noise readouts and quantitative enrichment at marker loci, enabling robust statistical comparisons.
- Translational Research: Connects chromatin state changes to disease-relevant gene expression, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other tissues with nuclear labeling, extending utility across diverse preclinical models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in regulatory genomics.
- Operational Value: Standardizes cell-type-specific ATAC-seq workflows, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in metabolic disease portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic and obesity-related targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nuclear isolation, FACS, and ATAC-seq library preparation.
- Demands access to transgenic reporter mouse lines with nuclear labeling capability.
- Relies on high-quality tissue samples and gentle handling to preserve nucleus integrity.
- Needs robust analytical infrastructure for sequencing and downstream bioinformatics.
- Adaptation to other cell types depends on availability of suitable nuclear labeling systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:51
Nucleus Isolation
2:15
Nucleus Sorting and Tn5 Tagmentation
4:08
DNA Purification and PCR Amplification
5:32
Real-Time Quantitative PCR (qPCR) Test, Additional PCR Amplification, and Second DNA Purification
6:14
DNA Fragment Size Selection
8:01
Results: Assay for Transposase-Accessible Chromatin with High-Throughput Sequencing
10:19
Conclusion
