جيل من الفئران ذات الضربة القاضية الخاصة بالدهون البنية باستخدام نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 والفيروس أحادي التوجيه المرتبط بالغدي
مارس 24, 2023
في هذا البروتوكول ، نصف الإجراءات الفنية لتوليد فئران بالضربة القاضية خاصة بالأنسجة الدهنية البنية (BAT) تستفيد من نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 والفيروس المرتبط بالغدي (AAV) أحادي التوجيه (sgRNA). تشمل الخطوات الموصوفة تصميم sgRNAs ، وإعداد جزيئات AAV-sgRNA ، والحقن الدقيق ل AAV في فصوص BAT.
يولد هذا البروتوكول فئران بالضربة القاضية خاصة بالدهون البنية باستخدام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 ونظام الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه المرتبط بالفيروس الغدي. يتضمن تقنية جراحية لإدارة AAV بأمان في الدهون البنية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تولد بسرعة خروج المغلوب الخاص بالأنسجة دون الحاجة إلى تربية الفئران بشكل انتقائي.
يمكن تكييف نهج صنع الضربة القاضية أو الضربة القاضية الخاصة بالأنسجة مع الأنسجة الأخرى إذا تم تعديل الإجراء الجراحي لحقن AAV بناء على العضو المستهدف. للبدء ، قم بتطبيق المسكن تحت الجلد على ماوس UCP1 Cre Cas9 المخدر لتقليل ومنع الألم والضيق بعد العملية الجراحية. ثم حلق الفراء في المنطقة بين الكتفين باستخدام ماكينة حلاقة ، وعقم المنطقة الجراحية بثلاث جولات متناوبة على الأقل من فرك قائم على اليود أو الكلورهيكسيدين ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
باستخدام مشرط ، قم بعمل شق بطول سنتيمترين في الجلد فوق الأنسجة الدهنية البنية بين الكتف لكشف الدهون بين الكتفين. بعد إجراء شق واحد ، قم بقطع الأنسجة الدهنية على الحدود بين المنطقة البعيدة من الأنسجة الدهنية والعضلات. ثم باستخدام المقص الجراحي في اليد المهيمنة ، قم بتقشير الأنسجة الدهنية بشكل صريح وعمودي لفضح الأنسجة الدهنية البنية أثناء قرص الأنسجة الدهنية ، بما في ذلك الأنسجة الدهنية البنية ، باليد غير المهيمنة.
استخدم وريد سولزر كمعلم للإشارة إلى موقع الأنسجة الدهنية البنية الدقيقة. بعد ذلك ، لكل فأر ، قم بحقن 20 ميكرولترا من الفيروس المرتبط بالغدي أو AAV ببطء في كل فص من الأنسجة الدهنية البنية باستخدام إبرة قياس 32 حادة متصلة بحقنة هاملتون سعة 100 ميكرولتر. تأكد من نجاح الحقن المشار إليه بعدم وجود تسرب من موقع الحقن أثناء إعطاء AAV.
بعد التأكد من التوازن ، ضع الأنسجة الدهنية المكشوفة مرة أخرى في وضعها الطبيعي لخياطة حافة الأنسجة الدهنية والعضلات باستخدام خيط حيدة قابل للامتصاص 5-0. أخيرا ، قم بخياطة الجلد المفتوح بخيوط مضفرة غير مصبوغة من VICRYL مغلفة 5-0. لا يمكن تحديد الموقع الدقيق للأنسجة الدهنية البنية دون تعريضها ، ومع ذلك ، فإن التعرض الزائد للأنسجة يلحق بالدم.
تضمنت العيوب المحتملة التي ربما أدت إلى الحقن غير الناجحة حقن محلول AAV في المنطقة غير الصحيحة ، واختراق الإبرة عبر الأنسجة ، وتضخم الأنسجة بسبب الحجم الزائد لمحلول AAV. كان التسليم الدقيق للحمض النووي الريبي أحادي التوجيه AAV إلى الأنسجة الدهنية البنية أمرا حاسما لنجاح البروتوكول. مفتاح النجاح أثناء تعريض الأنسجة الدهنية البنية هو تقنية المقص الجراحي ، بما في ذلك اتجاه وعمق المقص ، وموقع حقنة هاملتون.
تحتوي هذه التقنية على بالضربة القاضية خاصة بالأنسجة المولدة للحمل لفهم المنظمين الجزيئيين لاستقلاب الطاقة المرتبط بالدهون البنية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة لإنتاج فئران معدلة جينيًا بنظام التعطيل النوعي للأنسجة (knockout) في النسيج الدهني البني (BAT)، وذلك باستخدام مزيج من تقنيات Cre-LoxP وCRISPR-Cas9 والحمض النووي الريبوزي الموجه (single-guide RNA) المحمول على الفيروس المرتبط بالغدة (AAV). ومن خلال استخدام هذه الطرق، يمكن للباحثين إنشاء تعطيل جيني نوعي للأنسجة بسرعة دون الحاجة إلى التربية الانتقائية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- علم الوراثة
- بيولوجيا الخلية
- بيولوجيا جزيئية
خلفية علمية
- تعد الأنسجة الدهنية البنية ضرورية لعمليات أيض الطاقة.
- يساعد إنشاء تعطيلات جينية محددة للأنسجة في فهم العمليات البيولوجية.
- يمكن تكييف هذه الطريقة مع أنسجة أخرى محتملة.
الطرق المستخدمة
- تطبيق نهجي Cre-LoxP و CRISPR-Cas9.
- نموذج الفأر المستخدم: فئران UCP1 Cre Cas9.
- إعطاء AAV-sgRNA عبر الحقن المجهري الجراحي.
النتائج الرئيسية
- استهداف وتعطيل ناجح للأنسجة الدهنية البنية.
- إثبات فعالية الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) في تحرير الجينات الخاص بالأنسجة.
- التحقق من صحة التقنيات الجراحية الرئيسية لضمان دقة التوصيل.
الاستنتاجات
- تستعرض هذه الدراسة تقنية سريعة لإنشاء نماذج تعطيل جيني (knockout) ذات صلة باستقلاب الدهون البنية.
- تساهم الدراسة في تعزيز فهم المنظمات الجزيئية في استقلاب الطاقة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
إن التوليد السريع للفئران التي تعاني من تعطيل جيني متخصص في النسيج الدهني البني (BAT) باستخدام تقنيات Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 و AAV-sgRNA المدمجة يتيح تسريع الجينوميات الوظيفية في أبحاث التمثيل الغذائي. يعمل هذا النهج على تبسيط عملية التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الآلية للجينات المتورطة في تنظيم الطاقة، مما يقلل من الفترات الزمنية للدورة مقارنة بطرق التربية التقليدية. وتدعم هذه الطريقة قرارات محفظة المشاريع من خلال تقديم رؤى متخصصة في الأنسجة تعد بالغة الأهمية للاكتشاف المبكر والاستمرارية الترجمية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يسمح بالاستقصاء المباشر لوظيفة الجين في النسيج الدهني البني (BAT) لتحقيق الوضوح الآلي.
- يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال عزل تأثيرات الجين في نسيج ذي صلة بالمرض.
- يعزز الثقة التنبؤية في اختيار الأهداف الخاصة بالاضطرابات الأيضية.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر نماذج تعطيل جيني (knockout) مُصادق عليها للفحص المظهري اللاحق.
- يوحد الخلفيات الجينية لضمان الحصول على قراءات كمية قابلة للتكرار.
- يسرع من تطوير المقايسات من خلال تجاوز دورات التربية الطويلة.
الأبحاث الانتقالية والسريرية الأولية
- يوائم النماذج قبل السريرية مع آليات الأمراض الأيضية البشرية عبر تحرير الجينات الخاص بالنسيج الدهني البني (BAT).
- يمكّن من التقدم المدروس للمخاطر عن طريق توضيح مساهمة الجينات في عملية التمثيل الغذائي للطاقة.
- يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري في أبحاث التمثيل الغذائي.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة في مراحل الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف، مما يوفر جسراً للانتقال إلى تطوير النماذج قبل السريرية لمحافظ أبحاث التمثيل الغذائي والغدد الصماء.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات في تنظيم الطاقة بوساطة BAT.
- الفحص: توفر نماذج تعطيل جيني (knockout) قابلة للتكرار للمقاييس المظهرية الكمية.
- التحليلات: تمكن من قياس التأثيرات المحددة للجينات على المخرجات الأيضية داخل الجسم الحي (in vivo).
- الأبحاث الترجمية: تسهل مواءمة النماذج قبل السريرية مع بيولوجيا BAT البشرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: بروتوكول قابل للتكيف مع أنسجة أخرى عن طريق تعديل تسليم AAV، مما يدعم فائدة أوسع في البحث والتطوير.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من صحة الأهداف.
- القيمة التشغيلية: تبسط عملية إنشاء النماذج من خلال إجراءات موحدة وقابلة للتكرار.
- القيمة الاستراتيجية: تمكن من اتخاذ قرارات "المتابعة أو التوقف" (go/no-go) بشكل أسرع وتوزيع الموارد بكفاءة رأسمالية.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للأهداف الأيضية والغدد الصماء.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الحقن المجهري الجراحي والتحديد التشريحي للنسيج الدهني البني (BAT).
- يتطلب الوصول إلى بنية تحتية لإنتاج الفيروسات المرتبطة بالغدية (AAV) والهندسة الوراثية بتقنية CRISPR-Cas9.
- يستلزم توحيداً صارماً للمعايير بين الفرق لضمان قابلية تكرار النتائج.
- ضرورة تكييف البروتوكول لاستهداف أنسجة أو أعضاء أخرى.
- يعتمد النجاح على الدقة في توصيل AAV وتقليل تلف الأنسجة إلى الحد الأدنى.
