ملاقط مغناطيسية عالية السرعة للقياسات الميكانيكية النانوية على العناصر الحساسة للقوة

تخضع الجزيئات الحيوية لتغييرات هيكلية صغيرة وسريعة في كثير من الأحيان استجابة للقوة. يمكن للملاقط المغناطيسية عالية الدقة استكشاف هذه الديناميات تحت القوى ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. نظرا لأن الطريقة تقوم بإجراء قياسات نانوية بدقة ميلي ثانية ، فمن الممكن مراقبة التغيرات الطفيفة في الأحماض النووية والبروتينات في الوقت الفعلي.

يمكن أن تؤدي الأعطال في البروتينات الحاملة الأولى والبروتينات الحساسة ميكانيكيا إلى اضطرابات القلب والأوعية الدموية والعضلات والعظام. يمكن أن توفر الملقط المغناطيسي نظرة ثاقبة على آليات عمل هذه البروتينات. يجب محاذاة المجموعة ومعايرتها بشكل صحيح للحصول على دقة جيدة.

أيضا ، يجب توخي الحذر أثناء إعداد وتحديد التركيبات الجزيئية للقياسات. ابدأ بإعداد مجهر مقلوب على طاولة بصرية مضادة للاهتزاز. بعد ذلك ، قم بتثبيت كاميرا CMOS عالية السرعة وملتقط الإطار.

قم بتركيب مرحلة خطية آلية عموديا بطول سفر يزيد عن 20 ملم على مرحلة XY اليدوية لبناء مرحلة ترجمة لمعالجة المغناطيس في 3D. بعد ذلك ، قم بتثبيت محرك متدرج دوار ونظام حزام وبكرة لدوران المغناطيس. قم بتركيب المغناطيس على حامل أكريليك حيث يتم تباعد المغناطيسات المتوازية المتطابقة على بعد ملليمتر واحد.

اضبط الموضع الرأسي لمرحلة الترجمة بحيث يحاذي السطح السفلي للمغناطيس مستوى العينة في أدنى موضع للطورة. باستخدام عدسة موضوعية منخفضة التكبير ، قم بمحاذاة المغناطيس إلى مركز مجال الرؤية. تحقق من دوران المغناطيس للتأكد من أن إزاحة مركز زوج المغناطيس محدودة.

قم بتركيب صمام ثنائي فائق الانارة لإضاءة الخرز. مرر الشعاع عبر فجوة المغناطيس لضمان موازاة الحزمة بشكل صحيح لتناسب الفجوة وأن الإضاءة لا تظللها المغناطيسات. الآن قم بتثبيت ماسح ضوئي لعدسة Piezo على قطعة الأنف وقم بتركيب عدسة هدف الغمر بالزيت 100X بفتحة رقمية 1.5 لتتبع الخرز.

تأكد من أن الإضاءة موحدة مع حركة المغناطيس لتجنب القطع الأثرية المحتملة في تتبع الخرز. أخيرا ، اضبط الضوء على أقصى سطوع بدون تشبع البكسل. ابدأ بأخذ غطاءين زجاجيين لأعلى وأسفل الخلية.

قم بتنظيف أغطية الغطاء عن طريق صوتنتها في هيدروكسيد البوتاسيوم المولي لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اشطف أغطية الأغطية بالماء المقطر واحتفظ بها مغمورة في الماء. قم بتحريك الغطاء السفلي وتخزينه في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى.

في يوم التجربة ، جفف أغطية الأغطية بمسدس النيتروجين. لعمل القنوات البسيطة ، قم بإعداد شرائط بعرض ملليمترين تقريبا من الشريط على الوجهين ووضع أربعة شرائط موازية لبعضها البعض على بعد خمسة ملليمترات على الغطاء السفلي. الآن ضع غطاء علوي في وسط الغطاء السفلي تاركا مساحة حوالي خمسة ملليمترات على الحواف القصيرة لمداخل ومنافذ القناة.

باستخدام الملقط ، اضغط برفق على الجزء الخلفي من الغطاء العلوي لإغلاق القنوات بإحكام. قم بقص حافة طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر واقطع حوالي 10 ملم من الفتحة الأوسع للسماح لها بحمل أكثر من 200 ميكرولتر من المحلول. قم بإعداد ثلاث إبر حقنة تناسب أنبوب مضخة الحقن.

قم بتوصيل الإبرة الموجودة على مخرج قناة خلية التدفق بمضخة المحقنة باستخدام أنابيب البولي إيثيلين. موازنة القنوات مع برنامج تلفزيوني. إعادة تعليق مجاميع الخرز عن طريق دوامية محاليل الخرز.

ثم أدخل الحلول المطلوبة بالتتابع في القناة عن طريق الشفط بالمضخة. اغسل أي خرز غير منضم أثناء تطبيق 0.1 بيكونيوتون من القوة. على سطح قناة خلية السريان ، حدد الحبيبات المغناطيسية المربوطة بجزيئات مفردة من بنية الحمض النووي.

حدد موقع حبة مرجعية قريبة. قم بتدوير حبة المرشح للتحقق مما إذا كانت تدور بحرية. قم بتدوير الخرزات لبضع لفات أخرى وتقدير نصف قطر الدوران ، واختيار حبة ذات نصف قطر دوران أصغر.

قم بزيادة القوة من صفر إلى خمسة بيكونيوتون لتحديد حبات مربوطة واحدة جيدة من خلال البحث عن تغيير كبير في نمط حيود الخرز الناتج عن امتداد حبل زوج من خمسة كيلوقاعدة. باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد زوج من خمسة كيلوباس من شظايا الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل مع البيوتين في أحد طرفيه والأزيد في الطرف الآخر. بعد تحضير خلية تدفق مع منتج PCR ، قم بتسجيل إحداثيات X و Y للحبة المربوطة عند 1.2 كيلو هرتز والمغناطيس في وضع الراحة.

حرك المغناطيس بالقرب من خلية التدفق وكرر قياسات موضع الخرزة حتى بالكاد تلمس المغناطيسات الجزء العلوي من خلية التدفق. احسب القوة عند كل موضع مغناطيس D باستخدام أي من الطريقتين البديلتين. كرر قياسات القوة لبضع تركيبات أخرى من الحمض النووي بفحص ثلاث إلى خمس حبات لمتوسط تباين القوة بين الخرزات المغناطيسية.

بمجرد وضع حبة مغناطيسية مناسبة مع حبة مرجعية ، انقر فوق زر المعايرة لبدء التحضير لتتبع الخرزة. انقر على الخرز في الصورة لتحديد مواقع الخرز. للتتبع في الاتجاه Z ، سيقوم البرنامج بخطوة العدسة الموضوعية باستخدام ماسح ضوئي بيزو في خطوات متساوية البعد وتسجيل متوسط تذبذب صور الخرز في كل موضع لإنشاء جدول بحث.

قم بتمكين التتبع والتركيز التلقائي وانقر على زر الاكتساب لتسجيل مواضع الخرزة. أدى تطبيق القوة على بنية دبوس شعر الحمض النووي إلى نموذج سلسلة تشبه الدودة للتمديد الناجم عن القوة. في ستة piconewtons ، أظهر البناء تقلبات في الامتداد المرتبط بفك الضغط العكسي ، والذي اختفى عند ثمانية piconewtons وانقطع على منحنى نموذج جديد.

أظهرت تجارب تتبع دبوس الشعر عند 100 هرتز زيادة في التمدد ، لكن الرسوم البيانية لم تحل مجموعات سكانية متميزة. عند 1.2 كيلو هرتز ، كشف متوسط المسارات المفلترة عن مجموعتين متميزتين. ظل الفصل بين المجموعتين السكانية كما هو في نظام قوة فك الضغط.

أصبحت الدولة المفتوحة العليا مهيمنة تدريجيا مع زيادة القوة. تباينت معدلات الانتقال بشكل كبير مع القوة المطبقة التي تفضل فك الضغط وتثبيط إعادة الضغط. في نظام القوة المتوسطة ، تم الحصول على انحراف آلان من 2 إلى 3 نانومتر بأقصى سرعة.

تصرفت مقابض الحمض النووي لبنية معقدة SNARE كبوليمرات سلسلة تشبه الديدان. عندما تم تخفيف القوة من نظام أعلى ، عاد الامتداد إلى المنحنى الأصلي أو اتبع نموذجا جديدا. في 14 piconewtons ، فشل مجمع SNARE في الانتقال إلى الحالة غير المضغوطة ، في حين سمحت القوة المتزايدة بالانتقال.

تم تأكيد الكشف الكامل للمجمع عند قوى أعلى من خلال إعادة الطي التي لوحظت في اثنين من piconewtons. يعد تحديد حبال حبة العينة المشكلة بشكل صحيح أهم شيء يجب تذكره عند محاولة إجراء العملية. تتيح هذه الخطوة الاختيار الدقيق وبالتالي تحليل الهيكل المستهدف.

يمكن استخدام الملقط المغناطيسي أيضا لدراسة اللف الفائق للحمض النووي عن طريق تطبيق عزم الدوران. أيضا ، يمكن أن يقترن بالتصوير الفلوري لمراقبة تفاعلات البروتين المعقدة للغاية أو تتكشف.