منصة المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلايا لتقييم مثبطات فيروس زيكا في الوقت الحقيقي

العدوى الفيروسية ديناميكية للغاية ، ومقايسات نقطة النهاية التقليدية في علم الفيروسات لها قيود على أن نقطة النهاية المختارة يمكن أن تؤدي إلى فقدان المعلومات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه مع المعاوقة الكهربائية القائمة على الخلايا ، من الممكن متابعة العدوى الفيروسية ونشاط المركبات المضادة للفيروسات في الوقت الفعلي. سيوضح هذا الإجراء إيف ماين ، فني مختبر من مختبرنا.

للبدء ، قم بإعداد لوحة CEI عن طريق أخذ لوحة بئر 96 قائمة على القطب الرقمي. أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة النمو إلى كل بئر واملأ الفراغات بين الآبار باستخدام DPBS. ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات.

لبذر خلايا A549 ، افصلها عن قارورة المزرعة كما هو موضح في المخطوطة وأعد تعليقها في وسط نمو جديد. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر. عد الخلايا القابلة للحياة وقم بتخفيفها في وسط نمو جديد للحصول على كثافة الخلية المطلوبة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة وسط ثقافة النمو باستخدام ماصة متعددة القنوات من لوحة البئر 96. الاستغناء عن 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر. بمجرد موازنة الخلايا ، ضع اللوحة في جهاز CEI لإعداد وإجراء اختبار CEI.

افتح برنامج الجهاز، وفي جزء تجميع البيانات، انقر فوق إعداد لتعيين تجربة جديدة. قم بتوصيل كمبيوتر محمول بجهاز ECIS. قم بتكوين اللوحة عن طريق التحقق من معاوقة الآبار كما هو موضح باللون الأخضر.

في جزء تكوين البئر ، حدد نوع الصفيف وفقا لبرنامج الثقافة المستخدم وانقر فوق وضع وقت التردد المتعدد. ثم ابدأ القياس بالضغط على ابدأ. الحفاظ على المجمع على الجليد.

اصنع التخفيف المركز 10 مرات باستخدام وسيط فحص متوازن في أنبوب بولي بروبيلين سعة خمسة ملليلتر ثم أضف المركب. في جزء إعداد تجميع البيانات، انقر فوق إيقاف مؤقت، وبعد إكمال النقطة الزمنية الحالية، أخرج لوحة البئر 96. مراقبة الالتصاق وتشكيل أحادي الطبقة من الخلايا تحت المجهر الضوئي.

بعد ذلك ، قم بنضح 20 ميكرولترا من الوسط من كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات ، وأضف 20 ميكرولترا من المحلول المركب أو السيارة في الآبار المطلوبة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة. لتحضير محلول الفيروس ، قم بإذابة قارورة من مخزون الفيروس.

بعد إجراء التخفيفات في MOI المطلوب مع وسيط الفحص في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 ملليلتر ، أضف مخزون الفيروسات. بمجرد إضافة تخفيف الفيروس في الآبار المخصصة ، أضف 100 ميكرولتر من وسيط الفحص إلى آبار التحكم في الخلية. بعد ذلك ، قم بتطهير حاويات الفيروسات المستخدمة.

ضع اللوحة مرة أخرى في جهاز CEI وانقر فوق استئناف لمتابعة القياسات لمدة ستة أيام متتالية. لتحليل البيانات، انقر على إنهاء لإنهاء التجربة وإضافة إدخال ملخص التجربة. بمجرد اكتمال جمع البيانات، حدد موافق. حدد التردد المطلوب في جزء الرسم البياني.

تأكد من تحديد جميع الآبار في جزء تكوين البئر وانقر فوق ملف ، ثم تصدير البيانات ، متبوعا ببيانات الرسم البياني لتصدير البيانات بتنسيق جدول بيانات. أظهر اختبار CEI أن حركية العدوى كانت تعتمد بشكل كبير على نوع الخلية ، وكانت خلايا U87 عرضة فقط للإصابة بفيروس زيكا في MOIs عالية. أظهرت فحوصات CEI أيضا طبقة أحادية الخلية كاملة النمو عند بذر الخلايا العالية ولا يمكن أن تنتشر أكثر عبر أقطاب CEI ، مما يؤدي إلى اختلاف طفيف بين التحكم في الخلية ومكافحة الفيروسات.

بالنسبة ل U87 ، وهو نوع أكبر من الخلايا ، ربما أدى زرع الخلايا بكثافة كبيرة إلى الانفصال الكامل للطبقة الأحادية للخلية. أظهرت سلالة تمثيلية من فيروس زيكا من MR766 الأفريقي في السلالة الآسيوية PRVABC59 أنماطا مماثلة من CEI. ومع ذلك ، فإن PRVABC59 له خصائص أبطأ قليلا تحفز التأثير الخلوي ، والتي تنعكس أيضا في قيم CIT50.

وأظهرت ملامح المعاوقة لثلاثة أنواع مختلفة من MOIs لكلتا السلالتين من فيروس زيكا أن تركيز مركب معين أخر انخفاض المعاوقة الناجم عن عدوى فيروس زيكا. كشف اختبار CEI أن النشاط المضاد للفيروسات كان يعتمد على حسابات MOI و AUCN المحددة لقيم IC50. أظهرت قيم CIT50 التي تم تقييمها قدرات مركبة في حركية نمو الخلايا والعدوى.

CEI هي تقنية قوية لتقييم وتوصيف المركبات ضد تكاثر فيروس زيكا في الوقت الفعلي وخالية من الملصقات وغير جراحية.